Diagnóstico de la Laringotraqueitis infecciosa de las aves y caracterización viral

aves-granja

La laringotraqueitis infecciosa (LTI) es una enfermedad antigua pero que viene cobrando mayor importancia en los últimos años. La LTI es una enfermedad respiratoria aguda y altamente contagiosa de las aves causada por un herpesvirus de la familia Hespesviridae. Desde su primer relato en 1925, la enfermedad viene siendo descrita en varios países en los cuales permanece de forma endémica, principalmente en áreas de crianza intensiva, con alta densidad poblacional y aves de múltiples edades. El impacto económico sobre la industria avícola deriva de la alta morbilidad producida, la alta mortalidad, el efecto sobre la ganancia de peso y conversión alimenticia, y la disminución de la producción de huevos.

A pesar que todas las cepas del virus de la LTI (VLTI) son antigenicamente similares, estudios de protección cruzada y pruebas de neutralización e inmunoflorescencia determinaron que la virulencia varia considerablemente, resultando en infecciones que van desde subclínicas o asintomáticas (forma endémica) hasta una enfermedad respiratoria severa con alta morbilidad y mortalidad (forma epizoótica). Los signos clínicos asociados con la forma severa incluyen depresión, disnea, estornudos, descarga nasal, conjuntivitis y expectoración de secreción sanguinolenta. La tasa de morbilidad es alta (100%) y la mortalidad puede llegar a 70%, a pesar que frecuentemente varía entre 10 a 40%. No en tanto, en la forma endémica pueden ser observados signos inespecíficos como ligera traqueitis mucoide, sinusitis, conjuntivitis, morbilidad variable y baja mortalidad. Por supuesto, las presencia de otros patógenos involucrados y las condiciones medioambientales influyen en la severidad y presentación del cuadro.

Diagnóstico laboratorial tradicional

El diagnóstico de la enfermedad requiere de pruebas de laboratorio, puesto que dependiendo del grado de virulencia de la cepa, el cuadro clínico puede variar en intensidad y duración. Además de ello, muchos signos clínicos y lesiones producidas por el VLTI también son causados por otros patógenos respiratorios. Solamente en los casos de infección aguda con alta mortalidad y expectoración de sangre, la enfermedad puede ser diagnosticada basada en los signos clínicos y en la historia del lote, pero el diagnóstico laboratorial es requerido en casos de enfermedad suave y para confirmación de la infección.

Foto 1. Dispnéia de uma ave infectada com o vírus da laringotraqueíte infecciosa

Foto 1. Dispnéia de uma ave infectada com o vírus da laringotraqueíte infecciosa

A lo largo de la historia de la LTI, varias técnicas fueron descritas y probadas. Ellas pueden ser clasificadas en técnicas destinadas a detectar anticuerpos, antígenos o DNA del VLTI. A ellas se suman la histopatología, la cual se basa en la detección de lesiones microscópicas patognomónicas y el aislamiento viral.
Las técnicas para la detección de anticuerpos contra el VLTI incluyen la inmunodifusión en agar gel, seroneutralización viral, inmunoflorescencia indirecta (IFI) y ELISA indirecto. De estas técnicas, el ELISA es usado en varios países como técnica de triaje por ser práctico, rápido, fácil y por necesitar de pocas cantidades de suero y antígeno. Sin embargo, de ninguna manera estas técnicas pueden ser usadas para confirmación de casos o evaluación de la vacunación. La razón de ello es la pobre seroconversión de las aves naturalmente infectadas o inmunizadas con vacunas vivas. La respuesta inmune contra el VLTI es de tipo celular, y por lo tanto la producción de anticuerpos no es alta ni uniforme.

Foto 2. Traqueitis hemorrágica por laringotraqueitis infecciosa

Foto 2. Traqueitis hemorrágica por laringotraqueitis infecciosa

Entre las técnicas que detectan el antígeno viral se encuentran la inmunodifusión en agar gel (la cual presenta baja sensibilidad analítica); la inmunoflorescencia indirecta (IFD) (que a pesar de ser rápida tiene la desventaja de presentar muchas reacciones inespecíficas); la técnica de inmunoperoxidasa (que se muestra más simple, rápida y sensible que la IFD, pero tiene baja especificidad); y el ELISA directo (el cual es más eficiente que la IFD en la detección de antígenos del VLTI).

La histopatología continua siendo utilizada como técnica rápida de diagnóstico, y se fundamenta en la observación de sincícios en el epitelio traqueal, con corpúsculos de inclusión intranuclear, necrosis y hemorragia, sin embargo, como la necrosis y descamación destruyen el epitelio infectado, los corpúsculos de inclusión patognomónicos de esta enfermedad pueden ser detectados en la tráquea únicamente los cinco primeros días post-infección. De esta manera el diagnóstico es limitado, requiriendo la inclusión de varios animales en diferentes estadios de la enfermedad para poder llegar a un diagnóstico cercano al real.

El VLTI puede ser aislado en embriones de gallinas SPF, en células de cultivo primario e en células de linaje a partir de muestras de tráquea, faringe y conjuntiva. El virus aislado en huevos embrionados e inoculado vía membrana corioalantoide produce placas opacas como consecuencia de la proliferación viral. Sin embargo, varios pasajes pueden ser necesarios para observación de las lesiones. Aunque el aislamiento viral en células presenta una alta sensibilidad, el efecto citopático causado por la replicación viral en el sistema In Vitro puede demorar hasta cinco semanas hasta que sean observados. Por ello, pruebas más rápidas son frecuentemente utilizadas en combinación con el aislamiento viral, para acelerar el diagnóstico de la enfermedad. A pesar de ello, el aislamiento viral es requerido cuando los resultados de las pruebas rápidas son inconclusos.

Técnicas moleculares para la detección del VLTI

Las deficiencias de las técnicas anteriormente mencionadas, incluyendo las fallas en la obtención de resultados conclusivos o falta de especificidad, despertaron el interés en el desarrollo de técnicas más rápidas y específicas como la reacción en cadena de la polimerasa, la bien conocida y a veces poco valorada PCR.

La PCR ha sido utilizada con éxito para la detección de DNA del VLTI a partir de tráquea y de otros órganos como conjuntiva ocular y ganglios trigéminos, mostrándose una técnica altamente sensible y específica. La PCR se muestra más sensible que el aislamiento viral, tanto en la detección de infecciones agudas y latentes. Además de ello, esta técnica ofrece resultados rápidos, los cuales son requeridos para la adopción de medidas de control de la enfermedad.

La técnica está disponible en varios laboratorios de diagnóstico molecular, en tanto que, en el laboratorio de Patología Aviar de la Universidad de São Paulo, fue padronizada una reacción de PCR que mostró alta sensibilidad y especificidad analítica y relativa, cuando fue comparada con el aislamiento viral. Esta técnica fue eficiente en la detección de virus de muestras aisladas y de campo. Adicionalmente la técnica mostró ser tan sensible como las técnicas de PCR en tiempo real. La técnica de PCR en tiempo real o PCR cuantitativo permite además la cuantificación de partículas virales, lo cual es requerido principalmente en estudios de patogénesis y de protección.

Foto 3. Aislamiento del virus da laringotraqueitis infecciosa en membrana corioalantoide

Foto 3. Aislamiento del virus da laringotraqueitis infecciosa en membrana corioalantoide

La tráquea es el principal órgano de replicación viral, por lo tanto, es el tejido de predilección cuando muestras son enviadas al laboratorio para el diagnóstico. En un estudio realizado en nuestro laboratorio con muestras de 24 granjas positivas a LTI, el virus fue detectado en 78% de las muestras de tráquea, en 22% de las muestras de pulmón y en 52% de las muestras de conjuntiva. Las muestras conformadas exclusivamente por tráquea no mostraron resultados satisfactorios para el diagnóstico de la totalidad de casos positivos cuando fueron examinados por PCR. Entre tanto, se observó que asociando los tejidos de tráquea y conjuntiva, fueron detectados el 100% de los casos positivos. Estos resultados muestran la importancia de la obtención de las muestras de conjuntiva, siendo fundamental su inclusión en el diagnóstico de la LTI, tanto para casos sospechosos y para vigilancia epidemiológica.

A partir del cuarto día post-infección el VLTI migra a través de los nervios trigéminos al ganglio del mismo nombre. En este órgano, el virus se mantiene alojado sin replicarse por tiempo prolongado hasta un momento de estrés fisiológico del ave, después del cual reactiva su replicación. A este tipo de infección se conoce como infección latente y al ave con esta infección animal portador subclínico. Por lo tanto, el ganglio trigémino debe ser incluido cuando se busca la detección de casos de infección latente.

El VLTI puede ser transmitido tanto por aves con infección aguda o por fomites, por tanto es necesario un diagnóstico rápido y eficaz que permita la implementación de medidas que eviten la diseminación del agente a otros lotes y regiones. Así, la técnica de PCR se presenta como una herramienta adecuada para estos fines.

Caracterización molecular

La LTI fue la primera enfermedad de las aves controlada por uso de vacunas vivas. Existen dos tipos de vacunas vivas, las producidas en huevos embrionados (CEO) y las originadas de cultivo celular (TCO). A pesar que estas vacunas, en diferente grado, reducen la duración de la enfermedad y proteger a las aves susceptibles de las cepas de campo, varios inconvenientes fueron bien documentados. Entre ellas podemos citar la reversión de la virulencia después del pasaje por aves no vacunadas. Por ello, en muchos casos las vacunas vivas fueron involucradas en brotes de la enfermedad. A esta conclusión se llegó después que el virus aislado en el brote no pudo ser diferenciado molecularmente de las cepas vacunales.

Foto 4: Detección del virus de la laringotraqueitis infecciosa por PCR

Foto 4: Detección del virus de la laringotraqueitis infecciosa por PCR

Además de su uso como técnica de diagnóstico, la PCR en asociación con otras técnicas moleculares como la RFLP y la secuenciación de DNA vienen siendo usadas en estudios epidemiológicos que buscan conocer el origen de un virus causante de un brote clínico. La mayoría de publicaciones científicas de epidemiología molecular, usaron las técnicas de PCR y RFLP para conocer el origen de un virus aislado en un brote de la enfermedad. Con estas técnicas es posible diferenciar entre los dos tipos de vacunas vivas y las cepas de campo. En nuestro laboratorio, fue implementada una metodología que usa la PCR y la secuenciación con el mismo propósito. Los resultados fueron idénticos a los obtenidos usando la PCR y RFLP. Gracias a esta nueva metodología fue posible conocer el origen del mayor brote de la enfermedad en el Brasil. Esta metodología puede ser usada tanto para conocer en origen del virus causante de un brote, como en estudios de monitoreamiento epidemiológico, para conocer si nuevas cepas pueden estar circulando.

Las técnicas moleculares vienen siendo usadas masivamente en muchos países, principalmente en casos de la enfermedad de Gumboro y Bronquitis infecciosa, ya que las ventajas e información ofrecidas resultan de vital importancia para un correcto diagnóstico, paso inicial para la toma de decisiones dirigidas al control de las enfermedades.

Fuente:manualdeavicultura.blogspot.com

Fuente Original:actualidadavipecuaria.com
M.V. MSc. PhD. Jorge Luis Chacón
M.V. MSc. PhD. Antonio Piantino Ferreira
Universidad de de São Paulo