Marco Antonio Carvajal
Velázquez
Elanco® Animal Health Servicio Técnico Porcinos
Introducción
Análisis genéticos contemporáneos han confirmado que los primeros virus de Influenza Porcina (VIP) H1N1, los cuales son progenitores de los linajes “clásicos” H1N1 del VIP y los virus humanos de la pandemia de 1918 estaban estrechamente relacionados, ambos derivados de un virus ancestral totalmente aviar (Taubenberger y Palese, 2006).
Los virus de influenza son una de las mayores causas de brotes de enfermedad respiratoria aguda en cerdos (Loeffen et al., 1999; Terebuh et al., 2010), pero las infecciones son también frecuentemente sub clínicas.
La epidemiología de la influenza en cerdos abarcan una compleja interacción de virus de origen evolutivo humano, aviar y porcino. A la inversa, se ha postulado que los cerdos juegan un importante papel como huéspedes intermediarios en los eventos de recombinación y/o adaptación, encabezando el desarrollo de virus de influenza con potencial pandémico para la gente (Subbarao et al., 2006; Webster et al., 1992).
La recombinación genética entre virus humanos, de aves o porcinos en cerdos han sido documentados repetidamente en las pasadas dos décadas. Estos virus recombinantes han fundamentalmente alterado la epidemiología de la influenza en cerdos en muchas partes del mundo. Además, las pandemias humanas de 1957 y 1968 fueron originados por recombinación (Kawaoka et al., 1989), aunque no puede ser probado que dicha recombinación ocurrió en cerdos. Más recientemente la pandemia del 2009 por H1N1 se originó como resultado de recombinación entre VIP compartiendo linajes Norteamericanos y Euroasiáticos (Garten et al., 2009; Smith et al., 2009), y tampoco puede probarse que el evento de recombinación ocurrió en cerdos, personas o algún otro huésped del virus de influenza (Van Reeth et al., 2012).
Etiología
Los virus de influenza son miembros de la familia Orthomyxoviridae. Son virus envueltos, por lo que son muy susceptibles a detergentes y a la mayoría de los agentes desinfectantes antivirales comúnmente utilizados. Los virus de influenza codifican 10 a 11 proteínas virales en ocho segmentos separados de RNA en sentido negativo. La naturaleza segmentada del genoma permite a dos virus que co – infectan un huésped a intercambiar segmentos de RNA durante la replicación viral, un proceso conocido como recombinación genética (Van Reeth et al., 2012).
Los virus de influenza se clasifican por tipo, subtipo y genotipo. Se reconocen tres tipos: A, B y C. Sólo los virus de influenza tipo A tienen significado clínico como patógenos del cerdo. Los subtipos se definen por la hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N), glicoproteínas tipo espiga que se proyectan desde la superficie de la envoltura viral. Hay 16 diferentes formas de H y 9 de N que pueden ser distinguidas antigénicamente y genéticamente. La glicoproteína H media la adhesión a los receptores de ácido siálico en las células del huésped y es el principal objetivo en la producción de anticuerpos neutralizantes. A nivel molecular, el ácido siálico está unido a residuos de galactosa por uniones a2,3 (asociado a aves) y a2,6 (asociado a humanos).
Esta unión al ácido siálico es responsable de la aglutinación de eritrocitos, lo cual se utiliza para diagnóstico (hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación). La glicoproteína N permite al virus la liberación de la célula infectada por rompimiento de los depósitos entre el ácido siálico y residuos de azúcar adyacentes. Existen otros elementos estructurales del virus que nos ayudan a identificar su origen. Proteínas en la superficie externa (M1, M2), nucleoproteínas que cubren los segmentos de RNA viral (NP) y ligadas por un complejo de tres polimerasas (PB2, PB1 y PA). Además existen proteínas no estructurales (NS1, NS2). La genotipificación se conduce para determinar la secuencia genética de cada segmento de RNA viral y entonces se realiza un análisis filogénico. El resultado de este análisis define los linajes evolutivos.
Un linaje filogenético se refiere a un grupo de virus que comparten un origen genético común para un gene particular. Es posible para un virus contar con genes de diferentes linajes que reflejen diversos orígenes para genes individuales. La genotipificación ha sido una herramienta extremadamente importante en años recientes para entender el origen y evolución continua de los virus de influenza aislados de cerdos en el mundo. Para la nomenclatura de los virus A aislados se utiliza el siguiente acuerdo. A/especie de origen/ localización del aislamiento/número del aislamiento/año del aislamiento, por ejemplo A/Winsconsin/125/98. Si no se menciona la especie, por default es un aislamiento de humanos (Van Reeth et al., 2012).
Para que una pandemia se genere se requiere que emerja un virus de influenza con dos propiedades: 1) el virus debe ser suficientemente único antigénicamente para ser capaz de evadir la inmunidad del huésped en poblaciones humanas, y 2) debe estar suficientemente adaptado a infectar humanos para ser capaz de diseminarse de persona a persona (Van Reeth et al., 2012).
Los virus de influenza están sustancialmente restringidos por factores del huésped que limitan la infección inter especies (Landolt y Olsen, 2007), en particular entre aves y mamíferos. Así, sólo un pequeño subgrupo de subtipos del virus se han establecido endémicamente en mamíferos, por ejemplo, H1, H2 y H3 en humanos; H1 y H3 en cerdos; y H3 y H8 en equinos. En contraste, virus de influenza de todas las H y N han sido encontrados en aves acuáticas salvajes, el reservorio global de los virus de influenza (Webby y Webster, 2001). Dependiendo de la cepa de virus y especies de aves, los virus de influenza en aves acuáticas pueden infectar y ser excretados por el tracto respiratorio o digestivo (Webster et al., 1978). La infección entérica origina la excreción de virus por heces y contaminación del agua por semanas a meses. Esta condición puede jugar un rol en los brotes de influenza aviar, y posiblemente en la transmisión de aves a cerdos (Karasin et al, 2000 y 2004).
La pregunta frecuente en la virología del virus de influenza es ¿en qué especies se puede recombinar los virus de aves y mamíferos para producir un virus nuevo pandémico? En el cerdo, es la respuesta presumiblemente correcta porque los tejidos de los cerdos expresan receptores de ácido siálico a2,3 (asociado a aves) y a2,6 (asociado a humanos) (Nelli et al., 2010; Van Poucke et al., 2010) y pueden infectarse con ambos virus, favoreciendo la recombinación del genoma viral. Sin embargo la especificidad de las especies al ácido siálico es mucho más compleja de lo que se creía originalmente. Por ejemplo, un virus asociado a un determinado ácido siálico podría no generar una infección productiva en células pues se pueden requerir receptores secundarios (Chu y Whittaker, 2004). Más aún, humanos y algunas especies aviares terrestres expresan ambos tipos de ácido siálico (Landolt y Olsen, 2007).
Epidemiología
Los cerdos pueden ser infectados experimentalmente con un amplio rango de subtipos de virus de influenza aviar, e infecciones naturales han sido incluso documentadas en el mundo. Por ejemplo, H1N1, H3N2, H3N3 y H4N6 han sido aislados en cerdos en Canadá y Asia (Karasin et al., 2000 y 2004); y H5N1 y H9N2 en Asia (Takano et al, 2009). En general esta transmisión de ave a cerdo han sido eventos terminales epidemiológicamente hablando, sin mantenimiento en la población de cerdos. Así, el virus de influenza aviar podrían mutar o recombinar con virus adaptados al cerdo para replicar eficientemente, y cepas recombinantes con genes de aves y cerdos se pueden establecer en cerdos. El virus europeo H1N1 relacionado a aves es el ejemplo simple de un virus totalmente aviar que se adaptó al cerdo (Van Reeth et al., 2008).
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Virus de influenza humanos han sido ocasionalmente aislados de cerdos. En particular el H3N2 humano ha sido recuperado de cerdos en Asia y ocasionalmente en Europa y Norte América (Brown, 2000). Al igual que para virus de influenza aviar, la transmisión de virus humanos entre cerdos requiere la adaptación a la nueva especie huésped. Así, los virus H3N2 que se han mantenido en poblaciones de cerdos en Norte América y Europa son recombinaciones con una mezcla de genes de humanos y cerdos (Van Reeth, 2012).
Transmisión
Históricamente los brotes de influenza porcina ocurren al final del otoño y principio del invierno, asociados con el inicio de temperaturas más frías y lluvias de otoño. Sin embargo, estudios han demostrado que el VIP circula durante todo el año (Kyriakis et al., 2011), y en la medida que la producción de cerdos se ha movido a sistemas en confinamiento, la presentación temporal de la enfermedad se ha vuelto menos prominente.
Los modelos exactos de transmisión del VIP y su dinámica en la población se ha definido sólo en un grado limitado. Los virus de influenza son más comúnmente introducidos en las piaras a través del movimiento de animales.
La ruta primaria de transmisión del virus es a través del contacto cerdo – cerdo vía exposición nasofaríngea, con títulos virales en secreción nasal > 1 x 107 partículas infectantes por mililitro en el pico de excreción (De Vleeschauwer et al., 2009). La transmisión aerógena contribuye a la diseminación del VIP en áreas densamente pobladas con grandes piaras, incluso en granjas con excelentes medidas de bioseguridad. En la mayoría de los casos, el virus puede desaparecer de piaras en finalización, especialmente en aquellas con sistema de manejo todo dentro – todo fuera, para ser reintroducido más tarde. En granjas con sistema de servicio a venta, donde lechones susceptibles con inmunidad materna disminuyendo están continuamente disponibles, el virus puede ser capaz de persistir en la población en algunos casos (Loeffen et al, 2009).
Patogénesis
La patogénesis de la influenza en cerdos está bien caracterizada y es muy similar a lo que ocurre en humanos (Khatri et al., 2009). La replicación viral está limitada a las células epiteliales del tracto respiratorio (mucosa nasal, etmoides, tráquea y pulmones) y la excreción viral y transmisión ocurre exclusivamente a través de la vía respiratoria. El virus infectante puede entonces ser aislado de estos tejidos, así como de tonsilas y nódulos linfáticos en el tracto respiratorio, lavado bronco – alveolar y nasal, tonsilas o hisopos oronasales (De Vleeschauwer et al., 2009). En estu- dios experimentales el virus puede ser aislado desde el día 1 post – inoculación y es indetectable después de 7 días. El virus se puede aislar de los macrófagos alveolares, pero no hay pruebas de una infección productiva en estas células (Brookes et al., 2010).
El VIP difícilmente se encuentra fuera del tracto respiratorio. El cerebro es el tejido extra respiratorio donde pequeñas cantidades de virus son ocasionalmente aislados (Van Vleeschauwer et al., 2009). En unos cuantos estudios las heces, intestinos o bazo ocasionalmente resultan positivos por la prueba de PCR, pero células positivas al virus nunca han sido demostradas fuera del tracto respiratorio (Brookes et al., 2010).
La dinámica de la replicación viral en el tracto respiratorio, la severidad de la inflamación pulmonar y enfermedad son marcadamente dependientes de la ruta de inoculación y dosis. Las citoquinas producidas por el huésped durante el estado agudo de la infección aparentemente determinan la diferencia entre infección subclínica o enfermedad. Cualquier medida encaminada a reducir la extensión de la replicación viral en cerdos en el campo, por ejemplo inmunidad parcial activa o pasiva, o bien medidas sanitarias para reducir la presión de infección, reducen la severidad de los signos clínicos. Muchas citoquinas tienen efecto antiviral e inmuno estimulante, y pueden contribuir a la eliminación del virus (Van Reeth et al., 2012).
Estudios de infección experimental no han demostrado diferencia en la patogénesis o virulencia entre las cepas o linajes del VIP. Las diferencias ocasionales reportadas pueden ser debido a variación biológica ente cerdos, variación experimental o diferencias en la competencia de replicación entre virus (Sreta et al., 2009). Estudios de infección en cerdos con virus de influenza aviares o humanos típicamente resultan en una infección media o sub clínica, consistente con bajos a moderados títulos de virus en el tracto respiratorio porcino (De Vleeschauwer et al., 2009).
Diagnóstico Clínico
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El inicio de la enfermedad por un subtipo patogénico del VIP sobre cerdos susceptibles es muy rápido, después de un periodo de incubación de 1 a 3 días. La morbilidad es elevada (100%) pero la mortalidad es baja (menos del 1%) en casos no complicados. La recuperación es muy rápida (5 a 7 días) después del inicio del cuadro. Los brotes típicos por la infección por el VIP se caracterizan por:
• Fiebre elevada (40.5°C a 41.5°C). • Anorexia. • Inactividad. • Amontonamiento. • Reacios a levantarse. • Taquipnea (respiración acelerada superficial). • Después de unos días, tos. • Respiración abdominal laboriosa.
No hay diferencia en el cuadro clínico por cualquier subtipo: H1N1, H1N2 o H3N2, y virus de todos los subtipos y linajes han sido asociados con episodios respiratorios agudos (Krasin et al., 2000).
Estudios experimentales han fallado en demostrar diferencias convincentes en virulencia entre las cepas del VIP.
Muchos otros factores además del estado inmune pueden incluso determinar el resultado clínico de la infección por el VIP, incluyendo edad, presión de infección, condiciones climáticas, condiciones de alojamiento e infecciones concurrentes. Está bien establecido que infecciones secundarias con agentes como A. pleuropneumoniae, P. multocida, M. hyopneumoniae, H. parasuis y S. suis tipo 2 pueden incrementar la severidad y curso de la infección por el VIP (Van Reeth et al., 2012).
Otros virus respiratorios, como el Coronavirus Respiratorio Porcino y el virus de PRRS frecuentemente infectan cerdos de edad similar al VIP. Entre estos patógenos, PRRS, M. hyopneumoniae y el VIP son más frecuentemente detectados en cerdos de 10 a 22 semanas de edad con signos clínicos por la Enfermedad del Complejo Respiratorio Porcino (Thacker et al., 2001). En estos casos la infección es más severa que la infección simple.
Como consecuencia a un brote por el VIP, los productores y veterinarios ocasionalmente reportan reducción en el desempeño reproductivo, por ejemplo, incremento en infertilidad, abortos, camadas pequeñas y débiles, y mortinatos. Sin embargo, hay poca información que sugiera que el VIP infecta el tracto reproductivo o directamente induce enfermedad reproductiva (Van Reeth et al., 2012).
Lesiones
La lesión macroscópica asociada a la infección no complicada por el VIP es de una neumonía viral. El daño se observa principalmente en lóbulo apical y cardiaco del pulmón. El porcentaje de tejido pulmonar con consolidación visible varía entre y dentro de las infecciones experimentales, aunque más del 50% del pulmón puede estar afectado 4 a 5 días post inoculación (Khatri et al., 2010). Algo de edema interlobular puede ser evidente, los conductos aéreos pueden estar llenos de exudado fibrinoso sanguinolento, y los nódulos linfáticos asociados a los bronquios y mediastino están usualmente agrandados. En infecciones naturales de campo, estas lesiones pueden estar complicadas o enmascaradas por infecciones concurrentes, especialmente bacterianas (Van Reeth et al., 2012).
Microscópicamente, la lesión característica del VIP incluye la necrosis del epitelio pulmonar, descamación/ denudación de la capa celular del epitelio bronquial, y taponamiento de los conductos aéreos con células inflamatorias y epiteliales necróticas, principalmente neutrófilos, los cuales no sólo causan obstrucción de los conductos aéreos, sino que incluso contribuyen al daño pulmonar por la liberación de sus enzimas. Después de unos cuantos días se observa infiltración peribronquial y perivascular de linfocitos. Los signos clínicos o las lesiones pueden ser medias o inobservables (Van Reeth et al., 2012).
Diagnóstico
El diagnóstico clínico es sólo presuntivo debido a que no hay signos patognomónicos y el VIP debe ser diferenciado de una variedad de enfermedades respiratorias del cerdo. El diagnóstico definitivo es sólo posible por aislamiento del virus, detección de proteínas virales o ácidos nucleicos, o demostración de anticuerpos específicos del virus. Las técnicas diagnósticas a detalle están publicadas (Swenson et al., 2008).
La detección del virus, sus ácidos nucleicos o proteínas virales proveen evidencia definitiva de la presencia del agente etiológico. Los aislamientos del VIP en animales vivos son frecuentemente emprendidos en muestras de moco obtenido por hisopos nasales, o en el caso de animales muy pequeños, la orofaringe. El virus es más fácilmente encontrado en secreciones nasales y faríngeas durante el periodo febril de la enfermedad. Las muestras deben ser colectadas en poliéster (por ejemplo, Dacron®, Invista, Wichita, KS), y no en hisopos de algodón. Los hisopos se deben colocar en un medio de transporte, como medio de cultivo celular o fosfato buferado salino en pH neutro, y refrigerado (4°C). El virus puede también ser aislado o detectado de secreciones de tráquea o tejido pulmonar en cerdos muertos o sacrificados (eutanasia) en la fase aguda de la enfermedad, siguiendo el mismo procedimiento de transporte. El virus se puede cultivar en embrión de pollo o en cultivos celulares (Van Reeth et al., 2012).
Los subtipos H y N del VIP han sido determinados históricamente utilizando técnicas convencionales, como las pruebas de Inhibición de la Hemaglutinación (IH) e Inhibición de la Neuraminidasa (IN) (Swenson et al., 2008). Estos métodos subtipifican los virus utilizando anticuerpos específicos para cada subtipo H o N. Actualmente se utiliza más frecuentemente técnicas de PCR, secuenciación genética y microarreglo (Heil et al., 2010) que se basan en la detección de firmas únicas de los genes para diferenciar subtipos.
Pruebas de RT-PCR (tecnología tradicional y en tiempo real) proveen una elevada sensibilidad y especificidad para la detección del ácido nucleico viral extraído de muestras de campo. Métodos validados son equivalentes al aislamiento viral (Landolt et al., 2005), pero más rápidos, y menor costo, además de otras ventajas. Sin embargo se debe tener en cuenta que debido a la elevada sensibilidad de la prueba, muestras positivas débiles podrían contener virus degradado en lugar de virus activo (Van Reeth et al., 2012).
Las pruebas de RT- PCR se pueden clasificar en dos grupos. El primero permite la detección genérica de cualquier virus de influenza A y es aplicable a todos los VIP, pero no provee información del subtipo. Estos ensayos usualmente ofrecen elevados niveles de sensibilidad y especificidad, y son utilizados para el monitoreo inicial de muestras clínicas. El segundo son ensayos específicos para identificar subtipos de la H, incluso capaces de discriminar cepas dentro del mismo subtipo H. Tienen menos sensibilidad y menor utilidad para el monitoreo primario de la infección (Van Reeth et al., 2012).
Otros métodos para detectar el virus o el antígeno viral pueden ser aplicados a muestras de tejido fresco no autolisado del tracto respiratorio, principalmente pulmón y tráquea. Esto incluye la técnica de inmunofluorescencia directa o indirecta, o la detección inmunohistoquímica en tejidos fijados (Swenson et al., 2001). Además, hisopos nasales pueden ser probados en campo utilizando pruebas de membrana de inmunoensayo enzimático. Este método detecta el antígeno del virus de influenza A, pero no hay diferencia entre subtipos (Van Reeth et al., 2012).
Las pruebas serológicas son utilizadas para demostrar la presencia de anticuerpos específicos hacia influenza. El diagnóstico serológico de la infección aguda por el VIP requiere muestras pareadas tomadas con 3 a 4 semanas de intervalo. La serología es útil para determinar el estado inmune de la piara, niveles de anticuerpos maternos en lechones, y la dinámica de los títulos de anticuerpos post – vacunales, y para pruebas pre – movimiento de los cerdos (Van Reeth et al., 2012). La prueba de IH es la prueba más común para la detección de anticuerpos anti – VIP.
Hay también diversas pruebas de ELISA comerciales que pueden ser clasificadas en dos tipos. El primero detecta anticuerpos hacia influenza A. Estas pruebas generalmente tienen buena sensibilidad y son útiles para el monitoreo para detectar, por ejemplo, el estatus de la piara, pero no identifica subtipos. El segundo detecta anticuerpos específicos por subtipo. Estas ELISAs generalmente ofrecen una menor sensibilidad comparadas con la prueba de IH, pero pueden ser aplicadas en estudios donde el estado hacia una determinada cepa o subtipo del virus se requiere. Finalmente, las pruebas de IN presentan un desempeño similar a las pruebas de IH (Van Reeth et al., 2008), pero son sólo utilizadas en laboratorios especializados.
La interpretación de datos serológicos es compleja y puede confundirse con la circulación concurrente de diferentes subtipos de virus y linajes de genes. Esto es especial- mente problemático con co – circulación de cepas dentro del mismo subtipo, por ejemplo H1, poseyendo reactividad cruzada variable en pruebas que detectan anticuerpos a la H, como IH o IN, así como ELISAs específicas por subtipo (Van Reeth et al., 2012).
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Artículo publicado en Los Porcicultores y Su Entorno Noviembre-Diciembre 2013
