Determinación de la cantidad de clostridium perfringens y la longitud de las vellosidades intestinales

Determinación de la Cantidad de Clostridium Perfringens y la Longitud de las Vellosidades Intestinales en Pollos de Engorda de 6 Semanas de Edad Aparentemente Sanos

Guillermo García Hernández
Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Universidad Nacional Autónoma de México,

Nestor Ledesma Martínez
Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Universidad Nacional Autónoma de México,

Félix D. Sánchez Godoy
Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Universidad Nacional Autónoma de México,

Odette Urquiza Bravo
Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Universidad Nacional Autónoma de México,

Resumen

La cantidad de Clostridium perfringens (Cp) y la longitud de las vellosidades intestinales y en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos, fue determinada mediante el empleo de 40 pollos de engorda (PE) Cobb 500, suministrándoles alimento base Sorgo (65%) Soya (25%) y bacitracina (0.030%) así como agua a libre acceso. Las aves fueron sacrificadas al cumplir 6 semanas de edad y se tomaron muestras para bacteriología e histología. El estudio se llevó a cabo en dos grupos: 1) PE sacrificados con toma de muestras y procesado de las mismas directamente en granja y 2) PE sacrificados en laboratorio con procesamiento de las muestras en el mismo sitio. Solamente de las aves del segundo grupo se aisló Cp en promedio de 215 UFC/g de muestra. No hubo correlación significativa entre el número de colonias y el tamaño de las vellosidades intestinales en ambos grupos con la dieta proporcionada.

Introducción
El Clostridium perfringens (Cp) es una bacteria causante de Enteritis necrótica (EN), la cual es una enfermedad enterotoxémica que afecta principalmente al pollo de engorda de 4 a 8 semanas de edad o mayores aunque, también se ha descrito en pavos, patos y aves silvestres1,2. El Clostridium perfringens (Cp) es una bacteria anaeróbica Gram positiva y puede producir más de 13 toxinas3 . La vía de transmisión es horizontal debido a que el Cp puede estar en la caseta, suelo, insectos, aves silvestres, roedores y alimento contaminado.

Cabe mencionar que los clostridios son parte de la biota intestinal nativa de intestino grueso y sacos ciegos4-9 y son relativamente inocuos9,10 a menos que existan factores predisponentes como la coccidiosis 7,9,11-17, la impactación parcial del intestino grueso por ingestión de cama, grano o ambos, o la falta de provisión de piedras insolubles (grid), los cambios en la dieta7,14,15, la restricción alimenticia prolongada15. También el tamaño de la partícula del alimento menor a 4 mm puede predisponer al crecimiento de Cp3, la formulación alimenticia basada en cereales como el trigo1,4,14,15, centeno4,14 o cebada1,4,14,15, dietas con alto contenido de harina de pescado12,13, proteína con altos niveles de energía1,7,11 y el uso de proteínas de baja digestibilidad favorecen el crecimiento de Cp4. Además se ha descrito que los agentes inmunodepresores como las micotoxinas4,14 y largos periodos de retiro del coccidiostato3,4, también favorecen la disbiosis y por lo tanto la producción de sus toxinas3,14,9.

Con relación a la EN se comenzó a observar con mayor frecuencia en Europa debido a la prohibición del uso de antibióticos promotores de crecimiento, ocasionando pérdidas por más de 2 billones de dólares anualmente a la industria avícola mundial13, por decomiso de las canales al tener menor tamaño corporal y por las lesiones intestinales (hasta 4%) y hepáticas (hasta 12%) presentadas14.

La EN tiene 2 presentaciones, la subclínica, en la que las aves mueren sin haber mostrado ningún signo y la clínica en la cual las aves se reúnen en grupos, muestran el plumaje erizado, deshidratación3,12, depresión, anorexia1,7,13,14,16,18, se encuentran decúbito esternal12, con pérdida de peso4, disminución en la velocidad de crecimiento y aumento de la conversión alimenticia1,7,14,15, y finalmente sobreviene la muerte4.

La mortalidad y la morbilidad puede llegar hasta 10% en parvadas sin tratamiento6,19. El tiempo de incubación varía entre 7 a 10 días7.

Las lesiones macroscópicas que pueden ser observadas son: mucosa intestinal con presencia de necrosis coagulativa14 lo que da una apariencia aterciopelada (conocida como toalla turca)19 y puede estar completamente reemplazada por membranas diftéricas o pseudomembranas12,16 de color gris-café o amarillo-verde16 y restos celulares5. El intestino puede encontrarse friable y distendido con gas2,4,7,12,14,16. El hígado presenta focos necróticos de 2-3 mm en la superficie4, aumento de tamaño y palidez4,14.

La vesícula biliar puede estar aumentada de tamaño, delgada y con contenido claro y viscoso14, o inclusive puede romperse y causar peritonitis7. Por otro lado, las lesiones microscópicas que se han descrito es que inicialmente se encuentran en el ápice de la vellosidad y se caracterizan por pérdida del epitelio, edema, necrosis coagulativa y colonización bacteriana de la lámina propia expuesta, infiltrado heterofílico y de células mononucleares. Las lesiones secundarias se pueden apreciar en las criptas, capa submucosa y muscular del intestino11,13,14. La mucosa intestinal presenta abundante fibrina mezclada con restos celulares adheridos a la mucosa necrótica4,14 dentro de este material se pueden observar bacterias Gram positivas5,12,13.

Aunque la cantidad de Cp detectada en intestinos de los PE es variable, no existen estudios en México precisos que demuestren cuál es la cantidad normal de dichos microorganismos así como la relación que guarda con el tamaño de las vellosidades intestinales.

Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar la cantidad de Clostridium perfringens y la longitud de las vellosidades intestinales en pollos de engorda de 6 semanas de edad aparentemente sanos, alimentados con una dieta comercial mexicana para conocer si existe relación entre estas variables.

Cuadro 1. Resultados del estudio bacteriológico del grupo 2.

Cp en Grupo 2

Pollo

No. Cp UFC/g

1

270

7

220

8

500

11

100

17

100

18

100

_ X

Cuadro 2. Resultados de la relación estadística entre la
longitud de las vellosidades intestinales y la cantidad de
Clostridium perfringens por medio de la prueba de
Coeficiente de correlación simple de Pearson

Porción intestinal

Grupo 2

Yeyuno

r= -0.0277 NS.

Ileon

r= -0.1205 NS

Material y Métodos

Se utilizaron 40 pollos de engorda estirpe Cobb 500 de 6 semanas de edad, con disponibilidad de agua limpia y fresca ad libitum. Las aves fueron alojadas en una caseta de ambiente natural desde el primer día de edad hasta el final del estudio para posteriormente dividirlos en dos grupos de 20 pollos cada uno.

El alimento proporcionado fue con base Sorgo (65%) Soya (25%) y bacitracina (0.030%) como antibiótico promotor del crecimiento a libre acceso, hasta el final de la prueba.

Estudio Bacteriológico

Para la obtención de las muestras se amarraron 5 cm de la última porción del yeyuno junto con 5 cm de íleon de ambos grupos por separado en condiciones asépticas y se procesaron de la siguiente manera: Un gramo de cada muestra se maceró por separado y se depositó en 9 ml de Solución Amortiguadora de Fosfatos (PBS) estéril, para realizar diluciones décuples de 10-1 hasta 10-6. Posteriormente se sembraron 3 gotas de 20 μl de cada dilución en agar gelosa sangre19,20 y se incubaron durante 24 a 48 hrs a 37oC4,15, 19,20 en condiciones de anaerobiosis*19,20.

Una vez obtenidas las colonias con hemólisis doble se realizó la identificación por medio de pruebas bioquímicas1,21 glucosa, maltosa lactosa, sucrosa, indol, evaluación de la motilidad1,19,21 y leche tornasolada, además de observar morfología por tinción de Gram previamente.

Determinación de la cantidad de clostridium perfringens y la longitud de las vellosidades intestinales clostridium perfringens 2

Estudio Histológico

De los mismos pollos utilizados en el estudio bacteriológico se tomaron 20 muestras de yeyuno y 20 muestras de íleon de ambos grupos, con un tamaño de 1 cm, obteniendo la muestra de la parte caudal del yeyuno y la parte craneal del íleon de las muestras tomadas para bacteriología, introduciéndose en frascos con formalina amortiguada al 10% para su procesamiento22 y corte.

Se realizó un corte transversal de los segmentos de intestino obtenidos. Una vez obtenidas las laminillas se midieron 30 vellosidades intestinales de cada muestra, a partir de la cripta hasta el ápice de la vellosidad con un microscopio de luz** con el objetivo 4x y con el empleo de una cámara para la proyección de imágenes de microscopía en directo de alta resolución*** y un software especializado†.

Resultados

Estudio bacteriológico

Los resultados del análisis bacteriológico de las aves a las 6 semanas en los dos grupos no mostraron algún agente patógeno significativo en ninguno de los órganos.

En el estudio del grupo 1 no fue aislado Clostridium perfringens en ninguna de las aves, únicamente fueron encontradas bacterias de biota intestinal (Staphylococcus aureus y Actinomyces sp). En el grupo 2 fue aislado Cp en 6 muestras de intestino en la región de yeyuno e íleon. El promedio de colonias por gramo de heces fue de 215 UFC/g (Cuadro 1). Así mismo fueron aisladas bacterias de biota intestinal (Staphylococcus aureus, Actinomyces sp, Acinetobacter c
lcoaceticus, Alcaligenes faecalis).

Determinación de la cantidad de clostridium perfringens y la longitud de las vellosidades intestinales clostridium perfringens 3

Estudio histopatológico

En el grupo1 la longitud promedio de las vellosidades de yeyuno fue de 1284.452 μm con un rango entre 905.7333 μm y 1488.153 μm. La desviación estándar fue 38.418, mientras que la longitud promedio de las vellosidades de íleon fue de 1299.388 μm con un rango entre 805.933 μm y 1563.8 μm. La desviación estándar fue 1299.388.

En el grupo 2 la longitud promedio de las vellosidades de yeyuno fue 1478.434 μm con un rango entre 1311.36 μm y 1631.41 μm. La desviación estándar fue 103.193 y la longitud promedio de las vello- sidades de íleon fue de 1384.295 μm con un rango entre 1190.076 μm y 1486.316 μm. La desviación estándar fue 111.952 (Cuadro 2, Figuras 1 a 4).

Estudio estadístico

No se encontró relación estadísticamente significativa entre la longitud de las vellosidades intestinales y la cantidad de Clostridium perfringens en ambos grupos del experimento.

Discusión y Conclusión

Con la propuesta de regulación del uso de antibióticos promotores de crecimiento (APC) en México24 y el crecimiento de la demanda del consumidor por adquirir productos libres de APC es de vital importancia para los Médicos Veterinarios especialistas en aves conocer los valores esperados de UFC de Clostridium perfringens así como el tamaño de las vellosidades intestinales en PE sanos para poder tener una herramienta diagnóstica para prevenir la Enteritis necrótica.

Los resultados obtenidos en el grupo 1 del estudio fueron negativos a Cp, lo anterior es compatible con lo encontrado por Long JR et al., (1974)25 en un estudio realizado con pollos sanos, aves con signos de EN y aves muertas, en este estudio también se separó en 2 grupos, 1) aves enviadas al laboratorio y 2) casos de campo.

En el presente estudio en el grupo 2 se encontraron 215 UFC/g de muestra, pero durante la obtención de las muestras no se observó ninguna lesión en intestino delgado o grueso. Batalle M et al., (2009) mostraron que sólo los PE que presentaban valores por arriba de 107 UFC/g presentaban lesiones, así mismo, encontraron en el 82% de las muestras obtenidas un recuento de Cp menor o igual a 106, además encontraron que no había relación significativa entre las edades de las aves y el contenido intestinal de Cp26.

Figuras 3 y 4. Ejemplo de la medición de las vellosidades intestinales de pollos de engorda de 6 semanas de edad.

Por otro lado, Long JR et al., (1974)25 encontraron que los valores normales en PE sanos es de 0 a 105 UFC /g y Svobodovà I et al., (2007) en un estudio en la república Checa donde muestrearon PE sanos Cobb 500, alimentados con pellet comercial con coccidiostato los resultados encontrados fueron de 0 a 105 UFC/g27.

Con relación en los resultados del estudio bacteriológico en ambas fases de este estudio, se observó que son compatibles con la literatura anteriormente citada, ya que no hubo factores predisponentes para favorecer un crecimiento excesivo de Cp como lo podría haber sido con coccidiosis u otros factores.

En cuanto a los resultados del estudio histológico en este trabajo, el tamaño en las vellosidades intestinales es considerado como un primer estudio que refleja el tamaño de las vellosidades intestinales en México, en pollo de engorda de 6 semanas de edad sanos alimentados con una dieta comercial y antibiótico promotor de crecimiento, ya que la información disponible sólo cita el efecto de los estimuladores del crecimiento de vellosidades intestinales, además, actualmente no existe información precisa que relacione el tamaño de las vellosidades intestinales y la presencia de Cp bajo las condiciones anteriormente citadas.

Agradecimientos MVZ Israel Monroy Becerra, MVZ Salvador Noguez Torres, Tec. José G. González López, Tec. Alfredo A. Díaz Estrada.

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* BD Gas pack. U.S.A, 260413 ®
** Olympus Tokyo, Japón ®
*** Motic. China. Moticam 2500 ®
†Motic Images Plus 2.0 ®

Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno Agosto-Septiembre 2014

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