Mecanismos de Tropismo e Invasión

MVZ. M.C. MARCO ANTONIO
Juárez Estrada.
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Proteínas asociadas a la superficie del parásito

La invasión es un proceso multietápico activo que inicia con la reorientación y adhesión de la parte apical del esporozoito a la membrana citoplasmática del huésped, seguida por una rápida y progresiva internalización a la célula con la formación consecuente de la vacuola parasitófora intracelular en la cual el parásito invasor comienza su replicación.

Aunque algunos de los eventos de adhesión e invasión se encuentran ya en estudio avanzado, la identificación de proteínas de superficie en miembros de Apicomplexa aún no se encuentra bien dilucidada.

En algunos miembros de Apicomplexa, grupo al que pertenecen las coccidias de las aves, como son Cryptosporidium parvum, Plasmodium sp y Toxoplasma gondii, las mayores moléculas sobre la superficie de las fases invasivas primarias de estos parásitos invasivos son proteínas ancladas a través de moléculas de tipo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). Al igual que en estos protozoarios del grupo Apicomplexa, recientemente se ha observado que la superficie de esporozoitos y merozoitos de Eimeria sp también están cubiertos de proteínas –ancla de tipo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), que de forma genérica se describen como antígenos de superficie (SAGs) (Tabarés et al, 2004).

En el caso de Toxoplasma goondi y algunas especies de Plasmodium, las proteínas con ancla- GPI se encuentran involucradas en la etapa temprana de adhesión parasitaria previa a la reorientación apical, esta adhesión requiere interacción con los glicosaminoglicanos sulfatados que se hallan sobre la superficie membranal de la célula huésped. Información preliminar obtenida de investigaciones realizadas con E. tenella indican que varios tipos de SAGs tienen la capacidad para unirse a una amplia variedad de células cultivadas in vitro, lo cual sugiere que estos antígenos se encuentran también involucrados en las etapas iniciales de adhesión de manera inespecífica.

Figura 1. El análisis de la expresión SAG en cada una de las etapas específicas de replicación de una clona de E. tenella sugiere que el repertorio de expresión es más complejo durante la segunda generación de merozoitos.

El análisis de las secuencias tag ETS de E. tenella han identificado 37 variantes potenciales de SAGs ligadas a GPI codificadas por familias multi-gen y que se encuentran expresadas diferencialmente entre esporozoitos y la segunda generación de merozoitos (Tabarés et al, 2004; Reid et al., 2014) (Figura 3).

En eucariotas superiores las proteínas ancla- GPI regularmente se encuentran dentro de estructuras membranales conocidas como balsas lípidicas, las cuales son microdominios detergente- resistentes involucrados en señales de transducción, tráfico membranal y selección molecular.

Se han identificado balsas lípidicas potenciales sobre la superficie de los estadíos invasivos de Eimeria por medio de la tinción selectiva de un marcador para balsas lipídicas conocido como flotilina-1 (Del Cacho et al, 2007). Sin embargo, se observó que flotilina-1 fue más prominente en la parte final apical de los esporozoitos, mientras que las proteínas codificadas por los genes SAGs de E. tenella se expresan sobre la superficie completa de los esporozoitos (Tabarés et al, 2004).

Datos recientemente generados sobre transcriptomas, proteomas y el genoma de E. tenella, indican que este miembro de apicomplexa en particular llega a expresar hasta 80 proteínas SAGs diferentes, además, se ha confirmado que éstas se encuentran diferencialmente reguladas a todo lo largo del periodo de prepatencia en sus diferentes etapas de reproducción (asexual y sexual), por ejemplo, se ha visto que en la segunda generación de merozoitos, éstos se encuentran cubiertos con mezclas más complejas de SAGs que las mezclas observadas en esporozoitos o en merozoitos de la primera generación del parásito (Novaes et al, 2012; Reid et al, 2014) (Figura 4).

La localización superficial de los SAGs sugiere que éstos pueden inducir potentes respuestas inmunes que pueden llegar a bloquear la invasión de los esporozoitos a células cultivadas in vitro (Brothers et al, 1988; Kogut y Slajchert, 1992). La co-expresión de los merozoitos de SAGs altamente polimórficos puede dar como resultado que una respuesta inmune anti-SAG sea ineficaz contra estos estadios del parásito, lo cual explica la falta de éxito contundente de las vacunas recombinantes que se han generado contra este tipo de antígenos en comparación a los antígenos derivados de los cuerpos formadores de la pared de tipo II (WFBII) del gametocito, presentes principalmente durante la fase final de la gametogonia de E. maxima (Gam22, Gam56, Gam59, Gam82, Gam230, etc.), y que constituyen la base de la única vacuna comercial de carácter molecular generada hasta hoy en día (Wallash et al., 1995,2002; Belli et al., 2009).

Figura 2. Un pequeño número de genes SagA muestra un pico de expresión en cada estadio parasitario, mientras que todos los genes SagB se expresan en la segunda generación de merozoitos, lo que sugiere que éstos pueden ser importantes particularmente durante las etapas tardías de la infección.

Un estudio de 10 merozoitos de E. tenella que expresaban SAGs mostraron que tres de éstos inducían en macrófagos de pollo un incremento en la producción de óxido nítrico, en la transcripción de IL-1β e IL-10, al mismo tiempo que disminuían la transcripción de IL-12 e interferon-γ (IFN-γ) (Chow et al, 2011); lo cual indicó que al menos un subgrupo de SAGs muestran la capacidad para modular las respuestas inmunes de las aves de forma innata y adaptativa, lo cual podría indicar que de acuerdo al grado de expresión polimórfica de estos genes, algunos parásitos con patrones específicos de expresión génica podrían suprimir la inmunidad mediada por células y contribuir al incremento de respuestas de tipo pro-inflamatorio contribuyendo a exacerbar la patología asociada a las graves infecciones observadas con E. tenella.

Las proteínas micronemales participan como adhesinas y en funciones diversas en forma de complejos multi-proteícos.

El repertorio y funciones de las proteínas micronemales coccidiales incluyendo aquellas de las especies de Eimeria, han sido ya investigadas recientemente. Muchas proteínas micronemales comprenden aquellas que se encuentran presentes en arreglos modulares de diferentes dominios proteicos que muestran una gran analogía con las adhesinas de una gran diversidad de eucariotas, constituyen conectores o sitios de unión específicos de estos dominios a los glicanos de las células huéspedes, los cuales logran establecer así la unión apical irreversible del parásito a la células huésped. A lo largo de todos los miembros de Apicomplexa existen muchas proteínas micronemales ortólogas, aunque el arreglo preciso de los dominios no siempre se conserva y hay algunos como el dominio MAR unido al ácido siálico y el dominio Apple/PAN unido a galactosa, los cuales se encuentran restringidos a coccidia.

Las proteínas micronemales frecuentemente se unen para formar complejos heteroméricos de forma multivalente, los cuales se ensamblan dentro del retículo endoplásmico antes de ser trasladados a los micronemas. Cada complejo micronemal contiene una proteína de acompañamiento (escolta) que posee un dominio transmembranal y una cola corta citoplasmática, esto facilita que localicen a los micronemas y permite a los complejos micronemales interactuar con el glideosoma transmembranal.

Algunos complejos micronemales se encuentran conservados a través de diferentes géneros de Apicomplexa, mientras que otros no. Por ejemplo, el complejo TgMIC2/MIC2AP de T. gondii que es esencial para motilidad, unión a la célula huésped y para la invasión, es ortólogo al complejo EtMIC1/MIC2 de E. tenella. Experimentalmente, la introducción de este complejo de E. tenella dentro de los taquizoitos de T. gondii puede complementar parcialmente la pérdida del complejo endógeno TgMIC2/M2AP, indicando además que conserva su función (Huynh et al., 2004). Sin embargo, de forma inversa, el complejo TgMIC1/4/6 de T. gondii, en el cual TgMIC6 es la escolta para el dominio MAR que contiene TgMIC1 y el dominio de manzana (Apple) que contiene TgMIC4, no se han logrado replicar en E. tenella. Por otra parte, no se ha logrado encontrar en forma de complejo al dominio MAR que contiene EtMIC3 (Labbé et al, 2005), sin embargo, en lugar de ello, éste se secreta directamente a partir de los micronemas de Eimeria dentro de la superficie de la célula hospedera. El dominio Apple que contiene EtMIC5 forma un complejo con EtMIC4, el cual se cree actúa como un complejo escolta, pero éste también acarrea un dominio adhesivo similar a la trombospondina que tiene el potencial de unirse a los receptores de la célula huésped.

El reconocimiento de los glicanos de la célula huésped por parte de las proteínas micronemales contribuye al tropismo del parásito hacia los tejidos del huésped

Una de las preguntas más intrigantes que se ha planteado en la biología de los parásitos Apicomplexa, es: ¿Porqué existe una gran diferencia entre el tipo de huéspedes y el tropismo a tejidos específicos entre todos los miembros del mismo grupo de coccidias?, Toxoplasma goondi, por ejemplo, invade virtualmente cualquier célula nucleada e infecta a casi cualquier vertebrado de sangre caliente, mientras que cada especie de Eimeria infecta solamente a un sólo huésped, se replican únicamente en células epiteliales y comúnmente se encuentran restringidas a zonas muy específicas del intestino.

Estudios recientes sobre la unión de las proteínas micronemales coccidianas a los glicanos del huésped, particularmente al ácido siálico y la galactosa, han empezado a dar luz sobre este tópico. Generalmente, existe una correlación directa entre el rango de hospederos y el poseer un amplio repertorio de proteínas micronemales que expresan dominios variantes que son capaces de unirse a un amplio rango de epítopes oligosacáridos. Los dominios MAR, que se encuentran en las proteínas micronemales a lo largo de todos los miembros de coccidia, se unen a un rango de grupos de tipo sialil, sin embargo, evidencias sobre el tipo de microarreglos de carbohidratos, de estructura atómica y estudios sobre la unión a las células, revelan que los provenientes de T. goondi y E. tenella se encuentran equipados diferencialmente para esta unión. Lo cual quiere decir que los dominios MAR de E. tenella se unen a un rango limitado de estructuras, con una fuerte preferencia in vivo por el α2,3-ligando del ácido siálico y no se unen a cualquier estructura de tipo sialil N-glicolato (las cuales por cierto no se encuentran en los pollos).

En contraste, los dominios MAR de las proteínas micronemales de T. goondi son mucho más divergentes y se unen a una amplia variedad de oligosacáridos que incluyen al α2,9-ligando del ácido siálico y a derivados de N-glicolato, de allí su peligrosidad para todos los que nos puede invadir este parásito, especialmente mujeres embarazadas y gatos.

Trabajos recientes de investigación sobre el reconocimiento de carbohidratos por los dominios- Apple, encontrados también en proteínas micronemales de los miembros de coccidia, indican una contribución adicional a ampliar el rango de huéspedes y el tropismo a tejidos conferido por un reconocimiento diferencial de galactosa, otro azúcar que se encuentra amplia- mente distribuido en los tejidos animales, formando comúnmente ligandos tipo β1,3 o β1,4 a una glucosa o galactosa precedente. Mientras que ambos dominios- Apple de T. goondi y E. tenella se unen a estructuras galactosiladas, existe una preferencia marcada hacia Galβ1,3GalNAc de T. goondi, que se encuentra comúnmente sobre gangliósidos que son prevalentes sobre muchas superficies de las células huésped. Sin embargo, aún no se han dilucidado las preferencias precisas de unión del dominio- Apple de E. tenella, aunque, datos preliminares indican que éste se une predominantemente al ligando β1,4 de galactosa y no reconoce los ligandos β1,3 que son más comunes de encontrar en otros tejidos animales que no son el intestino de los pollos (Cowper et al., 2012).

Regulación de la secreción de los micronemas y roptrias

Las proteínas micronemales se vierten sobre la superficie del parásito durante la etapa temprana de la invasión. Sin embargo, aún se desconoce el evento fisiológico de disparo que induce esta secreción micronemal, aunque, experimentalmente al tratar a los parásitos con agentes que causan un incremento de calcio libre intracelular, esto logra inducir una rápida secreción, por lo cual esta liberación puede ser inhibida con agentes quelantes de Ca++ intracelular (Bumstead and Tomley, 2000; Wiersma et al., 2004). Al bloquear la liberación de los canales de calcio tratando a los parásitos con inhibidores IP3 o rianodina, o bien bloqueando la actividad de la kinasa cíclica GMP-dependiente o las proteínas kinasa dependientes de Ca++, todas estas estrategias interrumpen la exocitosis regulada de proteínas micronemales y por lo tanto previenen la unión del parásito a la membrana y la invasión a la célula huésped (Dunn et al., 1996; Wiersma et al., 2004; Lourido et al., 2010).

Las proteínas de las roptrias se secretan también de forma regulada, aunque se desconoce el mecanismo exacto de cómo sucede esto, se ha hipotetizado que la señal inicial se da a través de los extremos citoplasmáticos de la membrana unida a los complejos micronemales inmediatamente después de su interacción con los receptores de las células huésped. El proceso es complicado debido a que la secreción de las roptrias ocurre en dos diferentes oleadas. Las proteínas que se encuentran dentro de la porción anterior del cuello de la roptria (RONs) son secretadas tempranamente durante la invasión y son críticas para la formación y mantenimiento de la unión móvil de adhesión (MJ), mientras que las proteínas provenientes de la parte posterior de las roptrias (ROPs) son secretadas un poco más tarde, una vez que la vacuola parasitófora ya se encuentra formada.

Se conoce que en T. goondi, varias proteínas de las roptrias son potentes factores de virulencia que modifican y revierten rutas de señalización de la célula huésped. El modelo actual que explica la secreción diferencial de RONs y ROPs en T. goondi es que el complejo micronemal unido a la membrana celular contiene una proteína de acompañamiento la TgMIC8, la cual dispara la liberación de RONs. Las interacciones de RONs con la famosa proteína transmembranal micronemal 1 (AMA-1) disparan la l
beración progresiva de ROPs. La regulación de la secreción de proteínas ROPs/RONs en Eimeria, donde no existe un ortólogo definido de TgMIC8, no ha sido bien determinado a la fecha, a pesar de la cercanía genómica con T. goondi. Aun cuando se ha observado que AMA-1 muestra un bajo nivel de polimorfismo en comparación a AMA-1 de Plasmodium sp, lo cual muestra que puede ser un fuerte y potencial inmunógeno en la coccidiosis aviar al lado de SO-7, MZ5-7, GAM56 y GAM82.

Proteinas transmembranales micronemales (AMAs) y la formación de la unión móvil de adhesión (MJ)

La unión móvil de adhesión (MJ) fue visualizada ya hace muchos años, constituye la estructura clave que proporciona el ancla contra la cual el parásito puede generar la tracción que le permite ejercer movimientos hacia dentro de la vacuola parasitófora. Un componente clave en este evento es AMA-1, la cual es una proteína transmembranal secretada por el micronema sobre la superficie del parásito, donde esta interactúa con los RONs secretados secuencialmente, para así poder iniciar la formación de la MJ. La colaboración entre proteínas que son secretadas desde diferentes organelos sub-celulares requiere un marcado grado de coordinación. Recientemente ha emergido información, la cual describe que mientras AMA-1 permanece anclada sobre la superficie del parásito, un complejo de RON se secreta dentro de la célula huésped y entonces uno de ellos, RON2, comienza a insertarse dentro de la membrana de la célula hospedera e interactúa directamente con AMA-1. Ambos, AMA-1 y el repertorio de proteínas RON se encuentran bien conservados en Eimeria indicando que los mecanismos existentes que participan para formar la MJ también es probable que se encuentren conservados en otras coccidias diferentes a Toxoplasma o Plasmodium. Es pertinente comentar, sin embargo, que E. tenella expresa variantes periodo- prepatente-específicos de AMA-1 y de varias proteínas RON, lo cual sugiere que cada etapa del periodo zoito ensambla un diferente set de productos genómicos con los cuales construye su MJ.

La utilización de las proteínas de la fase prepatente de parásitos Apicomplexa como inmunógenos potenciales

Las estrategias para la producción de vacunas recombinantes efectivas que no necesiten de pasajes del parásito in vivo aun permanecen evasivas para el abordaje
de investigación que conduzca a resultados positivos, esto en el contexto faltante de descubrir el antígeno superficial o estructural, o bien los antígenos definidos que induzcan una respuesta inmune protectiva análoga a la inducida por las cepas vacunales vivas que hasta la fecha siguen utilizándose a pesar de algunas de sus desventajas. Un desafío en este campo lo constituye el tipo particular de genoma de los parásitos protozoarios como Eimeria sp (Novaes et al, 2012; Reid et al, 2014), otros parásitos de tipo metazoario e incluso de algunos microorganismos complejos, los cuales pueden codificar miles de genes, los cuales presentan una cantidad enorme de mezclas complejas de antígenos protectivos potenciales. La dificultad de identificar los inmunógenos relevantes dentro de esta gran cantidad de mezclas ha impedido seriamente el progreso hacia el desarrollo de vacunas recombinantes subunitarias que sean efectivas contra muchas especies de este tipo de parásitos Apicomplexa como Eimeria, Plasmodium, Toxoplasma, Cryptosporidium, Theileria, Babesia, Cistoisospora, Isospora, Hammondia y Trypanosoma. Un factor fundamental que ha limitado la identificación de candidatos vacunales efectivos ha sido la dificultad técnica de diferenciar entre las moléculas inmunogénicas que estimulan la respuesta inmune y las moléculas inmunoprotectivas que inducen una respuesta inmune protectiva efectiva (Melby et al, 2001; Crowe et al, 2006).

Muchos ensayos de proteómica, microarreglos, inserciones y análisis de bioinformática que buscan identificar antígenos protectivos en este tipo de parásitos no incluyen la protección inmune como criterio de selección, por lo cual al final es inútil considerar un antígeno como inmunoprotectivo si éste no se prueba in vivo (Ding et al, 2005). Es evidente como ya se ha revisado que existen numerosos componentes de un complejo antigénico en las diferentes especies de Eimeria que son capaces de estimular respuestas inmunes de memoria en los linfocitos T y B hacia proteínas como EtMIC2, SO7, MZ5-7, cSZ-JN-1, proteínas precursoras de la pared del gametocito de Eimeria e incluso contra el cuerpo stidae del esporozoito inhibiendo su exquistación, lo que muestra una reacción cruzada entre estructuras del mismo parásito, entre especies e incluso contra otros géneros del mismo orden (Ding et al, 2005; Matsubayashi et al, 2005; Ziomko et al, 2005; Krücken et al, 2008; Belli et al, 2009; Song et al 2015). Sin embargo, la naturaleza especie-específica de la inmunidad adquirida a través de la infección natural con Eimeria sugiere que tal reactividad antigénica cruzada no ha resultado ser siempre efectivamente protectiva, por lo cual, aún se requiere identificar, generar y probar las proteínas de Eimeria sp, más inmunogénicas que en forma de complejo inmune puedan proporcionar inmunoprotección efectiva de tipo específica (Ahmad et al, 2016).

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Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno Abril-Mayo 2017