MVZ José Víctor Ruiz Gómez
Director General
Laboratorios Cordobes de Diagnóstico Pecuario S.C.
correo: [email protected]

Uno de los grandes problemas cuando se van a enviar muestras a un laboratorio de Diagnóstico Avícola es que muchas veces no se tiene un diagnóstico presuntivo previo (pocos son los médicos que sí lo tienen). Por otro lado, hay un desconocimiento de las pruebas del laboratorio y no se sabe cómo aprovechar esas herramientas.

Antes de enviarlas o recolectarlas, es importante saber ¿Porqué y para qué se van a enviar esas muestras? ¿Qué es lo que esperamos obtener?

Los objetivos generales de la toma de muestras son:

•Evaluar de manera oportuna las medidas de bioseguridad, manejo, nutrición y sanidad empleadas.

•Determinar el estado de salud de una parvada.

•Detectar problemas sanitarios subclínicos.

•Evaluar la eficacia de los programas de inmunización.

•Cuantificar el grado de microbismo ambiental.

•Evaluar la calidad de los insumos y de los productos obtenidos.

•Evaluar la Calidad del pollo.

•Cumplir con las Campañas Zoosanitaria.

Problemática de un mal envío de muestras

¿Por qué al enviar al laboratorio no obtenemos lo que queremos?

• Por un diagnóstico Incorrecto. • Por una muestra inadecuada (autólisis, no era la muestra adecuada para hacer el diagnóstico, las aves no eran representativas del problema, porque las aves enviadas venían tratadas, etc.). • Por un mal envío de la muestra. Debemos tomar en cuenta que la exactitud de un resultado de laboratorio depende: •De una buena toma, buen envío y adecuada conservación de la muestra. •El resultado como consecuencia va a ser representativo de lo anterior.

Historia Clínica

Requiere de datos generales y específicos del problema:

• Nombre, dirección, teléfono, correo electrónico, a quién se va a facturar y a quién se deben enviar los resultados. • Nombre y localización de la explotación. • Estirpe, sexo, función zootécnica y edad. • Número de animales en la explotación. • % de morbilidad. • % de mortalidad diaria. • % de mortalidad acumulada. • Signos (Inicio). • Calendario de vacunación. • Tratamientos aplicados. • Consumo de alimento. • Consumo de agua. • Hay disminución de la producción (Huevo). • Hallazgos de necropsia.

Necropsia

Es una de las herramientas durante el proceso de diagnóstico que puede entregar mayor información acerca de la enfermedad. Las aves que se envíen para necropsia tienen que ser representativas del problema y tienen que estar compuestas, de aves que tengan diferentes manifestaciones de la enfermedad, en diferentes estadios, así como enviar también aves sanas. No se debe incluir aves remolacha (redrojos).

Existen diferentes formas de hacer la necropsia, lo más importante es que el veterinario que la realice, lo haga metódicamente y lleve a cabo una inspección completa de los órganos y sistemas de las aves.

Se deben tomar las muestras necesarias y todos los hallazgos deben ser analizados y anotados. El veterinario tendrá que emitir un diagnóstico presuntivo y más tarde confirmarlo con los resultados de los exámenes de laboratorio.

Hallazgos a la necropsia:

• Aportan datos importantes al histopatólogo.
• Le da idea si se trata de un problema o varios a la vez.
• Le permite correlacionar hallazgos de necropsia con hallazgos histológicos.
• Le ayuda a dar una mejor interpretación a los hallazgos histológicos.

Los cinco puntos mágicos de la descripción de lesiones son:

  • Tamaño
  • Forma
  • Color
  • Consistencia Relación anatómica.

En conclusión, los resultados de necropsia juegan un papel importante en el diagnóstico y en el control oportuno de las enfermedades en la avicultura.

Serología

Es una ayuda diagnóstica bastante utilizada, es económica y la mayoría de las veces sencilla.

Las pruebas serológicas se aplican en la avicultura con dos propósitos:

I. Diagnóstico: El conocer el nivel de anticuerpos contra una enfermedad “X”, nos permite diagnosticar si hay un brote de dicha enfermedad. Por eso para el diagnóstico de problemas infecciosos, resulta muy útil obtener sueros durante el brote y 3 semanas después, sin embargo se debe tener presente que la seroconversión es solamente una ayuda para el Diagnóstico y debe correlacionarse con otras observaciones de campo y laboratorio para alcanzar un diagnóstico definitivo.

II. Medir los niveles de anticuerpos: El conocer los niveles de anticuerpos circulantes, es útil para determinar la edad óptima de aplicación de la primera vacuna en pollos jóvenes, el seguimiento y la edad de revacunación.

Obtención de sangre:

• Decapitación

• Vena yugular

• Vena braquial

• Corazón.

Se debe enviar un mínimo de 30 sueros en popotes o frascos (esto puede ser variable, pero lo ideal es que entre más muestras de suero se envíen, mayor claridad tendremos, sobre todo cuando queremos ver cómo se está reaccionando la parvada a la aplicación de una vacuna “X”). Los sueros deben enviarse en refrigeración, bien empacados y sellados. Se puede utilizar papel filtro (por ejem- plo: Whatman # 1) para la recolección de sangre, 1 ml de sangre puede proporcionar de 0,3 a 0,5 ml de suero. Este debe obtenerse a temperatura ambiente, nunca al sol directo. Recuerde que se requiere siempre enviar de 1-3 ml de suero limpio (libre de coágulo).

Bacteriología

En general se puede decir que el estudio bacteriológico se basa en el aislamiento e identificación de las bacterias causantes de la enfermedad.

Los métodos más comunes para remitir las muestras son:

• La refrigeración (+ frecuente).

• La preservación en líquidos.

El fin de esto es evitar la pérdida de ese microorganismo o bien la de evitar la proliferación de otros microorganismos que pueden estar en determinado momento como agentes asociados.

Si se remiten órganos o tejidos frescos deben ponerse en recipientes estériles de boca ancha y tapa hermética, bolsas de biberón estériles o bolsas de plástico nuevas.

Las muestras tomadas deben ser a partir de aves recién sacrificadas o recién muertas con NO más de una hora de haber fallecido y Sin Cambios Posmortem. Es muy importante tomar las muestras de manera aséptica, para evitar que el agente principal quede enmascarado por el crecimiento excesivo de bacterias contaminantes, éstas deben obtenerse de los bordes de la lesión, incluyendo tejido sano, ya que la replicación de bacterias es más efectiva hacia los bordes de la lesión. Estas muestras deben tomarse antes de cualquier tratamiento de antibióticos. Cuando se incluyan hisopos se les debe agregar medio de transporte (medio Stuart o medio de Frey).

Deben provenir de órganos representativos.

• Para envío de: órganos, agua, vacunas, huevo, hisopos, etc., se usarán refrigerantes.

• Para bacteriológico de huevo, se envían éstos en bolsas de biberón estériles.

• El plumón se envía en bolsas de papel.

La interpretación de los resultados de bacteriología, como la interpretación de todos los resultados de labora- torio, debe realizarse con reserva. Un reporte negativo de aislamiento bacteriano no significa que el microorganismo que se sospecha, no sea el agente etiológico.

Existen muchas razones por las cuales un laboratorio puede fallar, en el aislamiento e identificación de una bacteria, entre ellas está el crecimiento de bacterias contaminantes, que generalmente crecen muy fácil en medios de cultivo comunes o por factores inherentes al muestreo.

Virología

Al igual que en la bacteriología, en un estudio virológico su objetivo es el aislamiento del agente causal que sospechamos que está produciendo el problema, por lo que es necesario las muestras adecuadas.

Las muestras deben ser tomadas del sitio “blanco” de infección tan temprano como sea posible después de que la infección ocurra, esto es válido principalmente para las infecciones virales, ya que la eliminación del virus es alta durante las primeras fases de la infección y enviarlas en un medio de transporte que nos ayude a mantener la viabilidad del virus.

Las muestras se obtienen, en forma similar a las muestras para estudio bacteriológico.

• Los recipientes deben ser estériles y la solución o caldo que comúnmente se utiliza para la preservación de la muestra, es solución salina buffer de fosfatos.

• La cantidad de líquido no debe ser menor de 10 veces el volumen del tejido.

• Una vez que la muestra ha sido tomada ésta debe ser refrigerada y congelada.

• Cuando se envían vacunas para titulación o pruebas de esterilidad deben enviarse en refrigeración (con refrigerantes) en su envase original y sin reconstituir.

• Enviar por lo menos dos frascos de vacunas que se desea titular, con el objeto de conservar la muestra, por si fuera necesario repetir la prueba o hacer aclaraciones.

A diferencia de las bacterias, los virus requieren de células vivas para replicarse y producir progenie.

Los virus se pueden propagar en un laboratorio en los siguientes sistemas: Cultivo celular, animales y huevos embrionados, éste último es el sistema de elección para propagar paramixovirus y ortomixovirus.

Histopatología

Es una de las herramientas más valiosas que se tienen para completar las observaciones hechas a la necropsia, ya que habrá lesiones que sólo al examen histopatológico se observen.

Puede haber lesiones que si bien no son patognomónicas, ayudan a completar el diagnóstico de la enfermedad y a confirmar el diagnóstico de campo. También habrá lesiones con las que se podrá dar un diagnóstico definitivo (patognomónicas o la identificación del agente dentro del tejido).

Las muestras se deben tomar de aves recién sacrificadas o con menos de una hora de muertas, debido a la putrefacción que puede sufrir el tejido.

El mejor fijador general para especímenes patológicos es la Formalina neutra al 10% estabilizada, preserva el número más grande de estructuras.

Fórmula de la Formalina Neutra

Formaldehido 37-40 %………………………………. 100 ml.

Agua Destilada ………………………………………….900 ml.

Fosfato de Sodio Monobásico …………………..4 g.

Fosfato de Sodio Dibásico………………………….6.5 g

Forma de enviar las muestras para el estudio histopatológico:

• Las muestras deben ser enviadas en una proporción de formalina neutra al 10%, de diez veces el volumen de la muestra.

• Se deben enviar pequeñas piezas de muestra de 1 a 2 cm de largo por 0.5 cm de grosor, para permitir una buena penetración del fijador al tejido.

Encéfalo: Debe meterse completo, con el objeto de ver distribución de lesiones o en caso de que se requiera para otra área, hacer un corte longitudinal y se toma la mitad para histopatología y la otra mitad para el área que se va a enviar.

Huesos: Deben estar limpios de restos de músculo y piel. Además deben ser cortados longitudinal- mente, con el objeto de que penetre el fijador.

Tráquea, cloaca, útero y tracto gastrointestinal: deben ser abiertos con cuidado, de modo de no dañar la mucosa y cortarse segmentos de 1-2 cm de largo.

Bolsa de Fabricio: debe enviarse de preferencia completa y hacérsele una pequeña abertura en uno de sus extremos, con el objetivo de que penetre el fijador.

Tejidos que flotan: sumergirlos con gasa y/o toallas de papel.

No congelar los tejidos antes y/o después de la fijación: Esto puede dañarlo y convertirlos en no aptos para el estudio histológico.

No refrigerar: Hace que aumente el tiempo de fijación de la muestra, hasta por tres o cuatro días y no se obtiene una buena fijación del espécimen.

• Los frascos con las muestras deben ser acompañados con una historia clínica del problema y perfectamente identificados, de preferencia que sean de boca ancha.

Descalcificación

• Se aplica por lo general a huesos

• Se hace la remoción de las sales de calcio sin alterar severamente los detalles celulares.

• Se utilizan diferentes métodos para descalcificar.Toxicología (Micotoxinas)

• Las muestras de alimento deben ser tomadas de diferentes partes de un depósito de alimento con el fin de tener mayores probabilidades de detección de toxinas.

• Las muestras deben ser enviadas en bolsas de papel identificadas individualmente. Nunca enviarlas en bolsas de plástico, ya que éstas aceleran la descomposición.

• Se deben tomar 500 g del alimento.

Parasitología (Coccidiosis)

• Las muestras pueden ser obtenidas directamente del ave o recolectadas del piso.

• Un monitoreo se compone de 5 a 10 muestras d eheces por caseta (mínimo 20 g).

Biología Molecular

BRONQUITIS INFECCIOSA

Diagnóstico:

Se realiza por RT-PCR anidado-RFLPs.

Resultados:

• Identificación de serotipos, e

• Identificación de variantes.

• Presencia o ausencia del virus de BI.

Muestras biológicas:

• Tráquea, Pulmón y Riñón.

• Aislamiento viral (Líquido alantoideo).

Envío:

• Muestras de órganos se colocan en bolsas selladas e identificadas.

• Desde su obtención hasta la llegada al laboratorio, las muestras de órganos o de líquido alantoideo serán conservadas en congelación o con hielo seco.

INFECCIÓN DE LA BOLSA DE FABRICIO

Diagnóstico: Se realiza por RT-PCR-RFLPs.

Resultados:

• Presencia o ausencia del virus IBF.

• Identificación de grupos moleculares.

• Identificación de variantes.

Muestras biológicas:

• Bolsa de Fabricio.

• Aislamiento viral.

Envío:

• Las muestras se colocan en bolsas selladas e identificadas.

• Desde su obtención hasta la llegada al laboratorio, las muestras de órganos o de líquido alantoideo serán conservadas en congelación o con hielo seco.

MICOPLASMOSIS EN AVES

Diagnóstico: Se realiza por PCR.

Resultado:

• Presencia o ausencia de M. gallisepticum o M. synoviae.

Muestras biológicas:

• Pollito de menos 1 semana de edad: tráquea y saco vitelino.

• Aves de mayor edad: Tráquea, pulmón e hisopos traqueales.

Envío:

• Las muestras deben ser colocadas en tubos con tapón de rosca (Falcon,Vacutainer) con 3 ml de medio Frey.

• Desde su obtención hasta la llegada al laboratorio, las muestras serán conservadas en congelación o hielo seco.

Antes de enviar muestras al laboratorio busque hacer lo siguiente:

• Un diagnóstico presuntivo lo más acertadamente posible del problema.

• Haga necropsias en campo.

• Procure hacer una buena selección de muestras.

• Si tiene la necesidad de dar tratamiento a las aves,

aparte aves sin tratamiento y que sean representa- tivas del problema, para posteriormente enviarlas al laboratorio.

Al enviar las muestras al laboratorio, asegúrese que:

• Estén bien tomadas y correctamente empaquetadas.

• Bien identificadas.

• Con el conservador necesario según el área del laboratorio.

• Con una buena historia clínica.

• Con los datos correctos para facturación, a quién deben enviarse y a quién se van a comunicar los resultados.

Recuerde que:

• Ninguna prueba es perfecta, porque no todas las aves infectadas tienen resultados a la prueba positivos y no todas las aves no infectadas tienen resultados negativos.

Varias precauciones deben ser consideradas en la interpretación de los datos de resultados de las pruebas diagnósticas:

• El aislamiento de un agente de aves enfermas puede no significar que el agente es directamente responsable de la enfermedad.

• El agente aislado puede ser un patógeno primario, una cepa vacunal, parte de la flora o un patógeno secundario.

• En algunas enfermedades especialmente enfermedades respiratorias, las infecciones bacterianas son comúnmente secundarias a agentes virales primarios y los intentos de aislamiento para virus son sin éxito, especialmente si las aves fueron remitidas tardíamente en el brote de la enfermedad.

• Un agente individual puede ser uno de varios agentes involucrados en la producción de la enfermedad.

• Es mejor usar un laboratorio, para una prueba dada, de manera que un rango familiar para negativo, bajo o títulos altos sea establecido.

• Diferentes laboratorios frecuentemente conducen pruebas serológicas usando diferentes reactivos o técnicas, a causa de eso la comparación de títulos de anticuerpos reportados de diferentes laboratorios puede ser confuso o causar confusión.

Los laboratorios no son infalibles y los veterinarios de campo necesitan considerar algunos puntos como:

• Características de la prueba que está siendo usada.

• Las precauciones contra la contaminación cruzada.

• La equivocación de otro laboratorio.

• Tecnologías alternativas para confirmar la observación.

• Respuesta a terapias.

• Costo de decisiones para llegar a un diagnóstico.

Finalmente es importante tener en cuenta que:

• Los resultados del laboratorio serán tan representativos del problema como lo sean las muestras recibidas.

Artículo publicado en Los Avicultores y su entorno Junio-Julio 2010