Coordinación:
Vet. Phd. Med. Carlos António de Carualho Fernandes
Internacional Prode
www.interprode.com
1. Introducción
La utilización de los dispositivos de liberación de progesterona, o sus análogos, está creciendo notablemente en los últimos años. Los dispositivos devinieron en herramientas terapéuticas de gran importancia para controlar el desarrollo folicular y la ovulación, principalmente luego de la incorporación práctica de biotécnicas reproductivas y de los conceptos relacionados a las “olas de desarrollo folicular”.
Actualmente, los implantes a base de progesterona se utilizan ampliamente en programas de transferencia de embriones, fertilización in vitro, sincronización de celos y principalmente en protocolos de Inseminación Artificial en Tiempo Fijo (IATF). Se cree que del 15 al 20% de las inseminaciones artificiales en Bovinos en Brasil se realizan a partir de un protocolo de sincronización del desarrollo folicular y de la ovulación. Según datos de la Asociación Brasileña de Inseminación Artificial (ASBIA, 2011), en 2010 se utilizaron en Brasil más de 3’500,000 protocolos de IATF.
El principio de la utilización de implantes de progesterona se fundamenta en el mantenimiento de los niveles hormonales cercanos a los observados durante la fase de diestro natural de los animales. Concentraciones plasmáticas fisiológicas de progesterona permiten el desarrollo folicular normal, además de bloquear el Centro Hipotalámico Controlador de la Ola preovulatoria de GnRH, logrando que la hembra permanezca sin ovular y sin manifestar comportamiento de estro. Variaciones en las concentraciones plasmáticas de progesterona influyen indirectamente en la dinámica de crecimiento folicular, ocurriendo un crecimiento folicular acelerado cuando las concentraciones circulantes son bajas (Ginther et al., 1989; Adams, 1994). Concentraciones plasmáticas de progesterona mayores a 0,8 ng/ml son necesarias para bloquear estros y ovulaciones naturales (Fortune, 1994). De esta manera, es importante evaluar si los implantes suministran cantidades suficientes de progesterona para viabilizar los eventos fisiológicos, sin alteraciones en el patrón de crecimiento folicular y consecuente fertilidad (Bigelow & Fortune, 1998).
El sistema de liberación de la progesterona del implante ocurre por gradiente de concentración, habiendo mayor pasaje del esteroide para la circulación del animal en situaciones donde el animal posee bajos niveles circulantes de la hormona. El mayor desafío de este tipo de dispositivo ocurre en animales sin presencia fisiológica de este esteroide, o sea, sin cuerpo lúteo (Adams, 1994).
2. Objetivos
2.1. Generales
Evaluar la eficiencia en hembras bovinas del producto Dispocel Max, un dispositivo intravaginal de progesterona que contiene 1,2 g de principio activo.
2.2. Específicos
Evaluar la concentración plasmática de progesterona por radioinmunoensayo (RIA) en los diferentes días durante la duración del implante en los animales.
Acompañar la dinámica de desarrollo folicular durante la utilización del producto.
Definir la eficacia del producto en un protocolo de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), precisando además del perfil plasmático de progesterona, la eficiencia de sincronización de la ola de desarrollo folicular y la tasa de ovulación.
3. Material y métodos
3.1. Lugares del estudio
Fase animal: Fazenda [Establecimiento Rural] União, Fama – MG.
Fase de Laboratorio: Departamento de Radiología y Reproducción Animal de la Unesp-Botucatu, SP.
3.2. Producto de prueba
Producto: DISPOCEL Max – Von Franken.
Dosificación: dispositivo intravaginal de liberación de progesterona, con 1,2 g de progesterona.
Preparación de la dosis: producto listo para su utilización.
Lote Nº: 01/11.
Fecha de vencimiento: 05/2013.
3.2.1. Manipulación, descarte y responsabilidad por los medicamentos
3.2.1.1. Precauciones de rutina adoptadas para el producto
Se utilizaron guantes adecuados para la manipulación de los dispositivos.
3.2.1.2. Instrucciones adoptadas para la aplicación de los dispositivos
Lavar el aplicador con solución antiséptica no irritante antes de la utilización en cada animal;
Encajar por completo el dispositivo en el aplicador;
Levantar la cola del animal e higienizar los labios de la vulva con papel toalla;
Con la cola del animal levantada, introducir el aplicador con el dispositivo en la vulva avanzando hacia la vagina, sin forzar;
Presionar el aplicador para expulsar el dispositivo.
3.2.1.3. Remoción de los dispositivos
La remoción se realizó suavemente de manera firme, tirando del cordón del dispositivo.
3.2.1.4. Descarte, reconciliación y registro de medicamentos
El lugar de estudio realizó un registro de identificación de los productos utilizados en el experimento. Todos los productos, utilizados o no, se devolvieron a Vallée al finalizar el estudio.
3.3. Animales
3.3.1. Instalaciones y administración de los alimentos
Las instalaciones utilizadas consistieron en pasturas de Brachiária (Brachiaria brizanta) con un área de 5,5 ha, con una capacidad de 2,0 animales/ha.
Durante todo el período de estudio, se mantuvo a los animales bajo las mismas condiciones del ambiente en el que fueron criados con luz y temperatura natural. Los animales que participaron del estudio no entraron en contacto físico con los animales que no estaban incluidos.
Las instalaciones de administración utilizadas consistieron en un corral con vallas de madera, tronco, cepos modelo americano y balanza para el peso de bovinos.
Los animales recibieron como suplemento ensilado de forraje y mezcla mineral completa durante todo el período experimental. Los animales tuvieron libre acceso a agua y las dimensiones de los comederos fueron adecuadas al número de animales incluidos en el estudio.
3.3.2. Criterios de inclusión
En el estudio se incluyó:
Hembras bovinas mestizas (Taurus X Cebú);
Edad entre 24 y 42 meses;
Peso entre 300 y 463 kg;
Buen estado de nutrición;
Buenas condiciones clínicas de salud;
Actividad reproductiva normal;
Libres de patologías del aparato reproductor.
3.3.3. Pre sincronización
Luego de la selección, quince (15) hembras pasaron por un protocolo de pre sincronización con el objetivo de eliminar o reducir la interferencia de la progesterona endógena durante la prueba.
Para el protocolo de pre sincronización, 10 días antes del inicio del período de evaluación (D-10), los animales recibieron un implante auricular de un (análogo sintético de la progesterona y la aplicación de valerato de estradiol. Esta última para provocar lisis del cuerpo lúteo que podría producir progesterona e influenciar en la dosis de este esteroide. Se optó por Norgestomed, por su efecto de impedir nuevas ovulaciones y por no detectarse en la medición de progesterona por RIA. El valerato de estradiol tiene efecto inhibitorio sobre la liberación de la hormona folículo estimulante (FSH), y es utilizado para sincronizar el desarrollo folicular (Bo et al., 1993).
Tres días antes del inicio del protocolo (D-3), se administró una dosis de prostaglandina para garantizar la destrucción de posibles cuerpos lúteos antes del inicio del estudio.
3.3.4. Criterios de exclusión
Se excluyó a los animales que:
Mostraron alguna señal clínica de enfermedad;
No estuvieron en buenas condiciones generales, a criterio del investigador;
Presentaron actividad luteal al inicio del tratamiento (D0);
Pérdida del implante.
3.3.5. Aclimatación
Durante el protocolo de pre sincronización, los animales fueron colocados en las mismas condiciones de realización del estudio por un período de 10 días, inmediatamente antes del inicio del estudio. En este período, se observó a los animales regularmente para constatar la salud de los mismos.
3.4. Procedimientos experimentales
3.4.1. Diseño del estudio
En el día cero del estudio (D0) los animales fueron evaluados por ultrasonografía y solamente se incluyó en el estudio a aquellos con ausencia de tejido luteal en los ovarios. Luego de la evaluación, fueron divididos en dos grupos, control y tratado. A los animales del grupo tratado se les retiró el implante auricular de Norgestomed, utilizado en la pre sincronización. En el grupo control, los animales permanecieron con el implante auricular durante todo el período experimental con el objetivo de hacer un grupo de “testigos”, en el cual los animales permanecieran con baja concentración plasmática de progesterona.
El mismo día (D0), el producto de prueba DISPOCEL Max, implante vaginal con 1,2 g de progesterona, fue aplicado en doce (12) animales, siguiendo estrictamente las recomendaciones del fabricante y utilizando equipos o aplicador propio para su inserción. Los animales del grupo control (n=3) pasaron por el mismo stress de gestión para la colocación del implante, no obstante, no recibieron el producto. El resto del protocolo fue común para los animales de los grupos tratado y control.
Para completar la gestión del D0, se administraron por vía intramuscular (IM) 2,0 ml de un producto a base de Benzoato de estradiol. El Benzoato de estradiol, suministrado en el inicio del protocolo hormonal, tiene como finalidad inhibir los folículos ováricos en crecimiento e inducir el desarrollo de una nueva ola folicular, que se inicia entre 3 y 4 días de la aplicación del principio (Bo et al., 1993: Martinez et al., 2000).
En el D8, los dispositivos vaginales fueron retirados de los animales del grupo tratado con la intención de reducir los niveles plasmáticos de progesterona y favorecer el desarrollo final del folículo pre ovulatorio. Paralelamente, para eliminar posibles tejidos de cuerpo lúteo en el ovario, se aplicó una inyección 2,0 ml de prostaglandina vía IM.
En el día D9, los animales recibieron una inyección intramuscular de 1 mg de benzoato de estradiol. Al final del protocolo hormonal, cuando la progesterona plasmática alcanza niveles inferiores a 0,8 ng/ml, el benzoato de estradiol favorece la liberación del pico pre ovulatorio de GnRH y el comportamiento natural de estro (Palhao et al., 2009).
Durante el período experimental, los animales fueron evaluados con respecto a la presencia de sintomatología anormal o a la pérdida del implante. El diseño experimental completo está representado en la figura 1.
3.4.2. Extracción de sangre
Para analizar el perfil plasmático de progesterona antes, durante y 12 horas después de la remoción de los dispositivos intravaginales, se recolectaron muestras de sangre en el D0 (a la tarde) antes del inicio del tratamiento, 12 horas más tarde en el D1 (por la mañana) y cada 24 horas hasta el D8. La última extracción se realizó en la mañana del D9, 12 horas después de la recolección del D8. El esquema de extracción de sangre está representado en la figura 1.
Para la extracción de sangre, los animales fueron apropiadamente contenidos en bretes adecuados para el manejo de bovinos. Se utilizaron tubos vacuolados e heparinizados, obteniendo la sangre por medio de la punción de la arteria o vena coccígea con una aguja de extracción múltiple 25×8. Las muestras se mantuvieron refrigeradas a 4oC hasta el momento de la centrifugación. En un intervalo menor a 6 horas después de la extracción, todas las muestras fueron centrifugadas a 1000 G por 10 minutos, a seguir, el plasma sanguíneo fue recuperado y almacenado a -20ºC en frascos eppendorf, debidamente identificados con el número del animal y la fecha de la extracción.
3.4.3. Dosificación de Progesterona
Las dosis hormonales fueron ejecutadas por radioinmunoensayo. Se utilizó el kit comercial (DPC Medlab®) de acuerdo a la metodología descripta por Leal et al., (2009). Los análisis se realizaron en el Departamento de Radiología y Reproducción Animal de la Unesp-Botucatu.
3.4.4. Ultrasonografía
Diez días antes del inicio del estudio (D-10), se evaluó a los animales por medio de ultrasonográfica transrectal (Mindray-2200 – DPS – Equipos médicos, con probe linear de 7.5 MHz) para verificar la actividad reproductiva. Solamente se incluyó en el protocolo de pre sincronización a los animales con cuerpo lúteo en la evaluación.
Comenzando en el día experimental cero (D0), los animales fueron examinados cada dos días con el objetivo de acompañar la emergencia y el desarrollo inicial de la nueva ola folicular ovárica.
A partir del día 8 (D8), los exámenes fueron realizados diariamente hasta el día experimental D11. Los exámenes ultrasonográficos realizados en este período objetivaron acompañar el desarrollo final del folículo dominante y observar la tasa de ovulación obtenida con el protocolo hormonal administrado. Luego de la remoción del implante de progesterona, se esperaba el desarrollo final del folículo ovulatorio, como también la sincronización de las ovulaciones. La secuencia de los exámenes ultrasonográficos está representada en la figura 1.
La nueva ola de crecimiento folicular estuvo acompañada por la medición del diámetro (promedio de dos medidas perpendiculares de la imagen del mayor diámetro del folículo) de los dos folículos más grandes. Se consideró como emergencia folicular la primera observación de un folículo en crecimiento con diámetro igual o superior a 4,0 mm. Todas las evaluaciones ultrasonográficas se anotaron en formularios específicos.
La ovulación fue definida como el desaparecimiento del folículo monitoreado y el diámetro pre ovulatorio fue considerado como la última medición del folículo antes de la ovulación. En los animales del grupo control no fue posible compilar los datos de evaluación ultrasonográfica en virtud de la falta de sincronía en el desarrollo folicular.
3.4.5. Análisis estadísticos
Los datos de concentraciones plasmáticas de progesterona (ng/ml) fueron sometidos a la prueba de Shapiro-Wilk y los datos que no actuaron normalmente se transformaron en logaritmos. Los datos puros o transformados para atender a los principios de la distribución normal se sometieron a la ANOVA. El cuadro de la ANOVA para las concentraciones de progesterona fue realizado con el modelo que contiene el factor Día. Cuando resultó significativo, el modelo fue desmembrado para evaluar las variaciones en las concentraciones de progesterona a lo largo de los días experimentales. Los promedios de las concentraciones plasmáticas de progesterona en cada día se compararon por la prueba de Tukey. Promedios y desviaciones estándar del diámetro folicular (en mm) en el momento de la emergencia y en el último examen ultrasonográfico antes de que se detecte la ovulación.
Todos los análisis se procesaron en el programa SAS (Versión 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) probabilidades menores a 5% fueron consideradas significativas.
4. Resultados y discusión
4.1. Administración de progesterona
Durante la ejecución del estudio, el animal 2066, perteneciente al grupo tratado, perdió el implante vaginal. El dispositivo se encontró el día 4 (D4), no obstante, no se pudo precisar el momento en que ocurrió tal hecho. Sus concentraciones plasmáticas de progesterona y los diámetros del folículo dominante fueron almacenados hasta el D4. El animal fue excluido del estudio y sus datos no se incluyeron en las estadísticas.
Otro animal del grupo tratado (1336) sufrió un accidente en el quinto día de evaluación (D5), lo que imposibilitó su permanencia en el estudio. Los datos de este último fueron recolectados hasta el D5 e incluidos en los análisis estadísticos. De esta manera, las concentraciones plasmáticas de progesterona se analizaron en 11 animales hasta el D5 y a partir del D6 el “n” experimental del grupo tratado se redujo a 10 animales en virtud de la remoción del animal 1336.
Los datos de las concentraciones plasmáticas de progesterona, a lo largo de los días, presentaron distribución normal y los análisis estadísticos se realizaron sin la necesidad de transformación de los valores. El modelo considerando el Día de la extracción de sangre, el Grupo tratado y la interacción GrupoxDía fue significativo (P<0,0001) y permitió encontrar diferencias entre los grupos tratado y control del día 1 (D1) al día experimental 8 (D8, Figura 2). La concentración plasmática de progesterona se eleva rápidamente luego de la colocación del implante, alcanzando significación estadística (P<0.001) 12 horas después del inicio del tratamiento (Figura 2).
Luego de la aplicación del dispositivo de progesterona Dispocel Max en el grupo tratado, ocurrió un rápido aumento en las concentraciones de progesterona, 12 horas entre la tarde del D0 y la mañana del D1 (Figura 2). Las concentraciones promedio de progesterona se mantuvieron arriba de 0,8 ng/ml, nivel que suprime la ovulación y la manifestación del estro (Hatler et al., 2008) durante los 8 días de utilización del implante. Esta situación es deseada, ya que el propósito del uso de progestágenos o progesterona en programas de inseminación artificial en tiempo fijo es inhibir la manifestación del estro y consecuente ovulación (Pursley et al., 1995). Luego de la remoción del dispositivo se observó una caída acentuada en las concentraciones de progesterona, retrocediendo a niveles similares a los del grupo control, 12 horas entre la tarde del D8 y la mañana del D9 (Figura 2). Este comportamiento también es deseable, ya que la caída de la progesterona permite el desarrollo final del folículo ovulatorio, permitiendo que la inducción de la ovulación se realice en otra etapa del protocolo (Pursley, 1995; Hatler et al., 2008).
4.2. Emergencia folicular y ovulación
De la misma forma que se procedió para las concentraciones de progesterona, las pérdidas de informaciones de los animales 2066 y 1336 se consideraron en los datos referentes al desarrollo folicular.
En el grupo tratado, la emergencia folicular ocurrió en promedio en el día 3 y el diámetro promedio del folículo dominante fue de 5,5 mm (Tabla 2). En el grupo control, en virtud de la no utilización de protocolos de sincronización de desarrollo folicular y dificultad de definir el estadio de desarrollo del folículo dominante (crecimiento o atresia), los datos del grupo control no se computaron y no fueron utilizados para el análisis estadístico de este parámetro.
Los animales 2316 y 2263 ovularon folículos menores a 10 mm (8,5 y 9,5 mm, respectivamente), los demás folículos ovulados presentaron diámetro mayor a 10 mm. En vaquillonas Holstein, el folículo dominante obtiene la capacidad ovulatoria con aproximadamente 10 mm de diámetro (Sartori et al., 2001). Animales de razas cebuínas muestran diferencias significativas en el patrón de crecimiento folicular, incluyendo el diámetro máximo y persistencia de los folículos dominantes, cuando es comparado a razas europeas (Viana et al., 2000). De esta manera, los animales utilizados pueden haber presentado características intermedias a las subespecies que componen el cruce (cebú x europeo). Ovulaciones de folículos menores a 10 mm se relataron previamente cuando vaquillonas de la raza Holstein fueron tratadas con benzoato de estradiol para inducir la ovulación (Palhao et al., 2009).
Todos los animales que completaron el estudio (n=11) ovularon (100%) y las ovulaciones fueron detectadas en el día experimental 11, o sea, 48 horas después de la administración del inductor de ovulación (1 mg de BE, D9). El diámetro promedio del folículo antes de la ovulación (D10) fue de 12,3 mm (Tabla 2).
El desarrollo del folículo dominante a lo largo de los días después del tratamiento está representado en la figura 3. El modelo estático, que contiene solamente el efecto de día, fue significativo. El folículo dominante creció en el intervalo del D4 al D6, se mantuvo relativamente estable hasta el D8, momento en el cual volvió a crecer, alcanzando el período de estancamiento nueve días después del inicio del protocolo (D9).
5. Destino de los animales luego del estudio
Una vez finalizado el estudio, los animales volvieron a la gestión normal del establecimiento rural de origen.
6. Conclusión
El producto Dispocel Max, con 1,2 g de progesterona resultó eficiente en mantener las concentraciones plasmáticas de progesterona arriba de 0,8 ng/ml durante el período de utilización, promoviendo rápida elevación y caída de los niveles plasmáticos de progesterona, respectivamente, después de la inserción y la remoción del mismo. Además, el producto demostró eficiencia en mantener el crecimiento folicular normal y sincronizar la ovulación de los animales sometidos al protocolo hormonal utilizado.
Referencias Bibliográficas
- ADAMS, G.P. Control of ovarian follicular wave dynamics in cattle: implications for synchronization and superstimulation Theriogenology. v.41, p.19-24, 1994.
- ASBIA 2011. Relatório estatístico de importação, exportação e de comercialização de sêmen. http://www.asbia.org.br/novo/upload/mercado/relatorio2010.pdf
- BIGELOW, K.L.; FORTUNE, J.E. Characteristics of prolonged dominant versus control follicles: follicle cell numbers, steroidogenic capabilities and messenger ribonucleic acid for steroidogenic enzymes. Biology of Reproduction. v. 58, p.1241-1249. 1998.
- BO GA, ADAMS GP, NASSER LF, PIERSON RA, MAPLETOFT RJ. Effect of estradiol valerate on ovarian follicles, emergence of follicular waves and circulating gonadotropins in heifers. Theriogenology; 40: 225-239. 1993
- LEAL,L.S. OBA, E. FERNANDES, C.A.C.; Sá Filho, O.G. Avaliação do corpo lúteo, contratilidade uterina e concentrações plasmáticas de progesterona e estradiol em receptoras de embriões bovinos. Ciencia Animal Brasileira, v.10, n.1, p. 174-183,2009.
- FORTUNE, J.E. Ovarian follicular growth and development in mammals. Biology of Reproduction. v.50, p.225-232, 1994.
- GINTHER, O.J., KASTELIC, J.P., KNOPF, L. Intraovarian relationships among dominant and subordinate follicles and the corpus luteum in heifers. Theriogenology, v.35(5), p. 787-795, 1989.
- HATLER TB, HAYES SH, RAY PS, REAMES WJ, SILVIA WJ. Effect of subluteal concentrations of progesterone on luteinizing hormone and ovulation in lactating dairy cows. The Veterinary Journal 2008; 177: 360-368.
- MARTINEZ MF, ADAMS GP, KASTELIC JP, BERGFELT DR, MAPLETOFT RJ. Induction of follicular wave emergence for estrus synchronization and artificial insemination in heifers. Theriogenology 2000; 54: 757-769.
- PALHAO MP, BEG MA, RODRIGUES MT, GINTHER OJ. Follicle and hormone dynamics in single versus double ovulating heifers. Reproduction 2009; 138: 561-570
- PURSLEY JR, MEE MO, WILTBANK MC. Synchronization of ovulation in dairy cows using PGF2alpha and GnRH. Theriogenology 1995; 44: 915-923.
- SARTORI R, FRICKE PM, FERREIRA JCP, GINTHER OJ, WILTBANK MC. Follicular deviation and acquisition of ovulatory capacity in bovine follicles. Biology of Reproduction 2001; 65: 1403-1409.
- VIANA, J.H.M.; FERREIRA, A.M.; SÁ, W.F.; CAMARGO, L.S.A. Follicular dynamics in Zebu cattle. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.35, n.12, p.2501-2509, 2000.
Artículo publicado en Entorno Ganadero
