Biología reproductivaDra. Ana Karen Vargas Ibarra.
Maestría en Ciencias Agropecuarias
Dr. José Antonio Herrera.
Laboratorio de Bioquímica de la Reproducción
Departamento de Producción Agrícola y Animal
Correo: [email protected]
Calderon CG.
Maestría en Ciencias Agropecuarias
Avalos RA.
Laboratorio de Bioquímica de la Reproducción,
Departamento de Producción Agrícola y Animal
Camarillo FR.
Maestría en Biología de la Reproducción.
Animal. Universidad Autónoma Metropolitana.
Quintana LJA.
Departamento de Aves, Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, UNAM.
Introducción
En la actualidad la avicultura de especies domésticas no se puede concebir sin la aplicación de conocimientos y tecnologías innovadoras de reproducción asistida. Esto incluye la inseminación artificial, con semen fresco, diluido o criopreservado, y la fertilización in vitro de óvulos. Una técnicas utilizada de manera esencial es la obtención de semen, se realiza mediante varias técnicas, que abarcan desde el electro-eyaculación, eyaculación voluntaria y eyaculación por masaje dorso ventral, esta última técnica propuesta por Burrows y Quinn 1937 para aves domésticas (Figura 1). En la industria avícola como en la ganadería, el uso de estas técnicas presenta ventajas como es el mantenimiento y reproducción de líneas puras (Herrera y col., 2013). Para lograr lo anterior en necesario conocer la biología reproductiva de cada especie y su manipulación in vitro e in vivo.
Biología reproductiva
Las aves han desarrollado un comportamiento reproductor más complejo que la mayoría de los vertebrados. Se reproducen mediante fecundación interna y ovopositan sus huevos provistos de una cubierta calcárea dura denominada cascarón (Cárdenas, 2004). En las aves domésticas se inicia el apareamiento con el cortejo y la frecuencia de apareamiento regularmente en el día.
Los gallos pueden copular de 10 a 30 veces, dependiendo la disponibilidad de las gallinas y la competencia de otros gallos. El volumen del semen eyaculado de gallos va de 0.1 a 0.3 ml, con una concentración de 6 a 10 x 109 espermatozoides/ml (McLean y col., 1998), sin embargo, el número de espermatozoides por eyaculación es pocas veces menor a 100 millones de espermatozoides, que es el mínimo requerido para lograr una alta fertilidad.
Fertilización
Después de la cópula, los espermatozoides de las aves pueden permanecer en el oviducto de la hembra hasta 3 semanas antes de llegar al sitio de fertilización conocido como infundíbulo, aquí los espermatozoides en contacto con el ovocito llevarán a cabo el proceso conocido como reacción del acrosoma, para penetrar la membrana perivitelina que rodea al vitelo y que contiene el ovocito (Lemione y col., 2009).
En la reacción acrosomal se fusionan las membranas plasmáticas y la membrana acrosomal. Esta fusión da como resultado la liberación de enzimas que ayudan a hidrolizar la membrana perivitelina del óvulo, auxilia al espermatozoide a penetrarlo y realizar la fertilización (Lemoine y col., 2008; Herrera y col., 2005). La membrana plasmática del espermatozoide y la membrana acrosomal interna del mismo, se fusionan con la membrana perivitelina se encuentra en la membrana plasmática del óvulo para liberar el núcleo del espermatozoide y la varilla sub acrosomal (perforatum) dentro del óvulo (Figura 2). La envoltura nuclear se desintegra cuando el espermatozoide entra al óvulo, posteriormente ocurre el intercambio genético (Etches, 1998).
Se ha reportado que la capacitación espermática en aves ocurre en periodos muy cortos y se produce en el tracto reproductor de la hembra, sin embargo algunos autores señalan que este proceso no es requerido para lograr la fertilización del ovulo y que los espermatozoides de las aves no requieren del proceso de capacitación para lograr la reacción acrosomal y su capacidad fertilizante (Lemoine y col., 2009 y 2011). Así mismo, se ha reportado que al momento de obtener un eyaculado una gran proporción de los espermatozoides ya cuentan con el proceso de capacitación. Este proceso implica diferentes mecanismos celulares que dan lugar a la desestabilización de la membrana del espermatozoide, el espermatozoide sufre un proceso de híper-activación. También se sabe que la capacitación y reacción acrosomal espermática se pueden lograr por incubación de los espermatozoides en un medio salino que contiene sólo iones de calcio (Ca2+) y membrana perivitelina (Lemoine y col., 2009).
Conservación seminal in vitro
Durante la conservación del semen debe mantenerse la movilidad de los espermatozoides si es que se quieren obtener altos niveles de fertilidad. La conservación del semen puede realizarse con dos técnicas, la conservación en fresco (recién eyaculado) y la congelación de los espermatozoides. El principio de la técnica se basa en la disminución de la temperatura de los espermatozoides de 41°C a 4°C ocasionando una disminución de la actividad química, que a su vez aumenta la vida de los espermatozoides (Barbas y col., 2009). La criopreservación es la que incluye sustancias crioprotectoras como el glicerol y el dimetilsulfóxido, que permiten el almacenaje espermático a temperaturas de hasta -196°C en nitrógeno líquido, en el cual pueden ser conservados por años los espermatozoides. Sin embargo otros estudios sugieren que los espermatozoides de gallo al igual que de mamíferos, después de un periodo de conservación in vitro presentan cambios membranales (Lemoine y col., 2011).
Evaluación seminal
Es requerida por que proporciona información de la calidad del semen, ayuda a predecir la capacidad fertilizante de los espermatozoides, avalado con el análisis de los espermatozoides vivos, la morfología y la actividad química que sufren (Umapathy y col., 2005), además de su estado fisiológico evaluado por las características de su membrana, en la cual se puede determinar su capacidad de reacción acrosomal. Los indicadores anteriores en conjunto se conocen como Índice de calidad espermática, lo cual se relaciona de manera positiva con la predicción de la capacidad fertilizante de los espermatozoides (Parker y col., 2002).
Evaluación de la reacción acrosomal
Para espermatozoides de mamífero, existen diversos procedimientos para la evaluación de la reacción acrosomal in vitro, para determinar la capacidad fertilizante del espermatozoide (Wishart, 2002). En el espermatozoide de gallo son pocas las técnicas utilizadas, sin embargo, la reacción acrosomal en espermatozoides de gallo pueden ser inducida in vitro con membrana perivitelina (Lemoine y col., 2009). El uso de Clortetraciclina, que es un antibiótico que al formar quelatos con el CA2+ produce patrones fluorescentes (Ochoa y col., 2014). Con lo anterior, es posible visualizar el curso de la capacitación espermática y reacción acrosomal. Usando CTC es posible diferenciar entre espermatozoides no capacitados, capacitados y con reacción acrosomal.
Objetivo
Por lo anterior en este estudio se pretende determinar en espermatozoides de gallos, los parámetros y los patrones de fluorescencia que se obtienen con el uso de clortetraciclina en espermatozoides recién obtenidos y co-incubados con membrana perivitelina homóloga
Materiales y métodos
Se cumplió con la Norma Oficial Mexicana 062-ZOO-1999 para el manejo de los gallos, para fomentar la producción, cuidado y uso de los animales mediante la aplicación de técnicas que garantizan la producción, proteger la salud y favorecer el buen uso de los animales. Se obtuvieron 50 eyaculados mediante masaje dorso ventral (Burrows y Quinn., 1937).
Cada eyaculado se depositó a 5°C, en 500 microlitros del medio Lake que contiene por cada L de agua desionizada, Glutamato de sodio 19.2 g, Fructosa 8 g, Acetato de potasio 5 g y acetato de magnesio 0.8 g. Se evaluó antes de los primeros 10 min de su obtención y después de 40 min de co-incubarse con membrana perivitelina y clortetraciclina. Por medio del microscopio se realizó su evaluación espermática básica, donde se determinó, la movilidad espermática y los espermatozoides vivos (Ahammad y col., 2013).
También se determinaron patrones de espermatozoides con y sin capacitación, capacitados y con reacción acrosomal, que se incubaron con Clortetraciclina, en obscuridad a 38°C, por 5 min (Ochoa y col., 2014). Para la inducción de la reacción acrosomal se incubaron los espermatozoides con membrana perivitelina homóloga (Lemoine y col., 2011).
Resultados y discusión
Los porcentajes de movilidad (90% y 85%) y de viabilidad espermática (96% y 93%) en espermatozoides de eyaculados recién recolectados y en aquellos co-incubados con membrana perivitelina respectivamente, se mantuvieron sin cambios (P>0.05).
Con el uso de clortetraciciclina, fue posible identificar tres patrones característicos (Figura 3), los cuales están asociados con su mayor proporción a la condición de estudio, pudiendo determinar que corresponden a espermatozoides intactos o no capacitados, espermatozoides capacitados y espermatozoides con reacción acrosomal.
Los parámetros de reacción acrosomal, evidenciaron que el porcentaje de espermatozoides intactos y con reacción acrosomal fueron distintos (P<0.05), Con un mayor porcentaje de espermatozoides intactos en el semen fresco y cuando se determinó el porcentaje de espermatozoides con reacción acrosomal después de su inducción con membrana perivitelina. El porcentaje de espermatozoides capacitados se mostró sin cambios, sin embargo es posible a que esta etapa del espermatozoide sucediera en un corto periodo menor a 40 min, lo cual explica los porcentajes de espermatozoides intactos y reaccionados en aquellos co-incubados con membrana perivitelina, en comparación con los porcentajes determinados en el semen fresco (Tabla 1).
Cuando los espermatozoides son co-incubados con membrana perivitelina el porcentaje de espermatozoides reaccionados se incrementan, por ello nuestros resultados apoyan que la membrana perivitelina entre sus componentes contienen progesterona y Ca2+ los cuales han sido identificados por otros autores como inductores de la RA en espermatozoides de aves (Lemoine y col., 2009; Ahammad y col., 2013). En nuestro estudio podemos apreciar un incremento de aproximadamente el 50% de reacción acrosomal después de su inducción, a pesar de que otros estudios reportan porcentajes después de la inducción de 27-31% utilizando también membrana perivitelina homóloga (Mocé y col., 2010).
Conclusión
Evidenciamos con nuestros resultados, que con el uso de clortetraciclina, es posible la evaluación del estado funcional de espermatozoide de gallos, pudiendo determinar parámetros de espermatozoides con capacitación y con reacción acrosomal además de la de los espermatozoides de llevarla a cabo ante un inductor como la membrana perivitelina lo cual reafirma que es un método in vitro que contribuye a predecir su capacidad fertilizante in vivo.
Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno
