Mediante la determinación de la presencia de virus vacunal HVT con la Técnica de PCR punto final

Norma Patricia Ficachi García.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad del Valle de México.

Ledesma-Martínez Néstor.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Nacional Autónoma de México.
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Memorias XLI Convención Aneca

RESUMEN

Debido a la importancia clínica y económica de la enfermedad de Marek (EM) en aves de combate, el método de control más efectivo y más utilizado en la práctica es la vacunación al día de edad. Sin embargo, es muy importante la evaluación de la efectividad de la vacunación para garantizar que el ave se encuentra protegida contra virus de campo. Con este propósito, se llevó a cabo la detección de la presencia del serotipo 3 (HVT) vacunal de la EM mediante la técnica de PCR punto final a partir de folículo de la pluma de aves de combate. Con base a los resultados se identificaron a las aves positivas a HVT que habían sido vacunadas de manera que se corrobora la efectividad de la vacunación. Por otro lado, se identificaron aves que son negativas a la presencia de HVT y que por lo tanto no están protegidas contra virus patógenos, a pesar de haber sido vacunadas. Los resultados de este estudio sugieren que la técnica utilizada puede ser una alternativa de evaluación de la efectividad de la vacunación. Adicionalmente se encontraron aves que son HVT positivas y que se reportaban como no vacunadas por lo que esto puede ser un indicio de la excreción del virus vacunal reportada en la literatura pues se encontraban en contacto con las aves vacunadas.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Marek (EM) en aves de combate tiene gran importancia clínica y económica debido a que ocasiona enfermedad inmunodepresora y lesiones linfoproliferativas en diversos órganos y tejidos1,2; lo cual se traduce en pérdidas económicas por concepto de bajo rendimiento productivo en las aves; tanto para el combate (machos) o reproductivamente (aves reproductoras). Por otro lado, su incidencia es muy alta, llegando a mencionarse como la enfermedad viral más frecuentemente reportada3 en aves de combate remitidas al Laboratorio de Diagnóstico e Investigación en Enfermedades de las Aves, UNAM, en el periodo de 2000 a 20114.

Debido a que el Virus de la Enfermedad de Marek (VEM) está distribuido mundialmente y su transmisión es a través de las escamas de la piel de las aves infectadas, la mejor medida de control de la enfermedad es la vacunación al día de edad en la planta incubadora1.

Sin embargo, la efectividad de la vacunación en las aves de combate se encuentra condicionada a diversos factores: no todos los nacimientos ocurren en una planta incubadora (no todas las aves son vacunadas al día de edad), e incluso en las plantas incubadoras no se vacunan a todas las aves. Adicionalmente, la presentación vacunal disponible es la de virus vivo liofilizado, lo cual significa que el título vacunal disminuirá en función del tiempo a partir del momento en que sea reconstituida inclusive manteniendo la cadena fría. Tomando en cuenta la ventana de nacimientos, las aves que nazcan primero recibirán un mayor título vacunal que las aves que nazcan tiempo después, lo cual puede resultar en que las aves no se encuentren protegidas a pesar de haber sido vacunadas.

Es por esto que es transcendental determinar si la vacunación fue efectiva y brinda o no protección a las aves. Por esta razón, se propone la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) punto final a partir del folículo de la pluma como alternativa de evaluación de la vacunación. El objetivo del trabajo es la determinación de la presencia del virus HVT de vacuna contra la enfermedad de Marek en el folículo de la pluma, ya que, si el virus vacunal se encuentra presente, el ave se encuentra protegida contra la infección de campo. Asimismo, la técnica de PCR permite la evaluación rápida de múltiples muestras al mismo tiempo, además de ser altamente sensible y específica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizaron 15 aves de combate de las cuales se obtuvieron 4 plumas de la región costal. Identificadas con números consecutivos como sigue:

Del 1 al 5: Gallos no vacunados (Zapotitlán).

Del 6 al 10: Gallos vacunados (Zapotitlán).
11, 13, 14 y 15: Gallos de los que se desconoce si fueron vacunados (Tijuana).
12: Gallo con signos nerviosos sugerentes de EM (Zapotitlán).

A partir de la pulpa del raquis de las plumas se llevó a cabo la extracción de ADN mediante la técnica de Todd92 modificada5. Brevemente, 250μl de solución de lisis fueron mezclados con 250 μl de suspensión de pulpa 12.5 μl de proteinasa K [20mg/ml] fueron incubados a 37°C por 2 horas para posterior extracción mediante 1 volumen de fenol cloroformo alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con etanol. Las pastillas de ADN fueron resuspendidas en 50 μl de agua destilada y congeladas hasta su utilización. Se utilizó una vacuna HVT comercial como testigo positivo de extracción.

Las muestras de ADN se utilizaron en la técnica de PCR con un volumen final de 20 μl mezclando 1X de amortiguador de PCR, 0.2 mM de dNTP’s, 1.5 mM de MgCl, 0.5 mM de cada iniciador, 2.5 U de Taq polimerasa, 3 ml de ADN y agua destilada cbp 20 μl. Los iniciadores utilizados fueron:

S O R F 1 F 5’ G G C A G A C A C C G C G T T G T A T 3’
S O R F 1 R 5’ T G T C C A C G C T C G A G A C T A T C C 3’

Que amplifican un fragmento de 250 pb de la región SORF1 del herpesvirus del pavo.

Las condiciones de termociclador fueron las siguientes:

Terminada la corrida de PCR las muestras fueron separadas en geles de agarosa al 1% y teñidas con bromuro de etidio 5 μg/ml por 10 min y visualizadas con luz UV.

RESULTADOS

De las 15 muestras totales, 9 fueron positivas y 6 negativas. Las muestras positivas corresponden a las muestras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 y 10. Las muestras negativas son las muestras 7, 11, 12, 13, 14 y 15.

Figura 1: Geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio.

DISCUSIÓN

En el caso de las aves vacunadas y positivas, la vacunación a la que fueron sometidas fue exitosa y el virus vacunal pudo replicarse y diseminarse exitosamente hasta llegar al folículo de la pluma, proveyéndole protección contra cepas de campo.

Por otro lado, en las aves positivas pero que no fueron vacunadas, es posible que debido a que ambos grupos son de la misma región, éstas hayan sido expuestas al virus HVT vacunal a través de la descamación de la piel de las aves que sí fueron vacunadas, en las cuales el virus vacunal se replicó1,2 y finalmente fue diseminado al ambiente, en el cual se encontraban las aves no vacunadas y que de este modo fueron infectadas por el virus HVT y fueron inmunizadas imprevistamente contra infecciones por virus de EM de campo.

En el caso de las aves provenientes de Tijuana, a través de esta técnica pudo determinarse que no están protegidos contra la infección de campo6, ya sea porque no fueron vacunados o bien, porque la técnica de vacunación no fue apropiada. Por otro lado, el gallo de la muestra 12 fue negativo a la presencia de HVT y puede decirse que, si efectivamente presenta signos clínicos inducidos por la EM, esto sugiere que se trata de un serotipo 1 de campo, aunque no puede afirmarse con certeza. Cabría la posibilidad en un futuro de desarrollar una técnica para la identificación de otros serotipos.

CONCLUSIONES

Con base en los resultados puede deducirse que las aves positivas a la presencia del virus HVT se encuentran inmunizadas contra infecciones de EM de campo y esto efectivamente pudo determinarse a través de la utilización de la técnica de PCR punto final a partir del folículo de la pluma en aves de combate. Por otro lado, resalta la trascendencia de la evaluación de la eficacia de la vacunación ya que el hecho de que un ave se encuentre vacunada no garantiza la protección contra serotipos patógenos.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA

1. Swayne DE and Glisson JR ed. Diseases of Poultry. 13th ed. USA. Iowa State Press; 2013 p. 515-552.
2. Brugère-Picoux J and Vaillancourt JP. Manual de patología aviar AFAS 2015. P. 220- 226.
3. Ramos-Jiménez JC. Estudio epidemiológico sobre la situación actual de la enfermedad de Marek en aves de combate en la zona metropolitana de la ciudad de México (delegaciones Iztapalapa, Tláhuac, Milpa alta y Xochimilco). Tesis de maestría Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. 2012.
4. García-Reyes AL. Principales enfermedades en aves de combate remitidas al Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México durante los años 2000-2011. Tesis de licenciatura de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. México D.F. p. 13-15.
5. Montesinos-García LD. Efecto del uso de gentamicina en combinación con vacuna contra la enfermedad de Marek en pollitos de un día de edad. Tesis de maestría de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. México D.F. p. 12-17.
6. Witter RL. Increased virulence of Marek ́s disease virus field isolates. Avian Dis. 1997: 41: 149 – 163.

Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno