Pruebas y Métodos para el Diagnóstico de Mastitis II

CARLOS BEDOLLA CEDEÑO
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.
Correo: [email protected]

INTRODUCCIÓN

En una primera parte de este trabajo se hizo referencia a las principales pruebas y métodos para realizar el diagnóstico de mastitis en el ganado bovino, los cuales resultan ser de gran importancia para diagnosticar este problema que es muy frecuente en el ganado productor de leche y que ocasiona grandes pérdidas económicas a los productores en todo el mundo.

Primero, se abordó lo referente a lo qué es la mastitis y las formas cómo ésta se presenta en el ganado.

Enseguida, se hizo referencia al método de observación y palpación de la ubre, y se describió cada una de las pruebas físicas empleadas para realizar el diagnóstico de la mastitis bovina, dentro de las cuales se analizaron: la prueba de escudilla de ordeño, prueba de paño negro y taza probadora, las cuales se encargan de diagnosticar mastitis clínicas. Por otra parte, también se hizo referencia a las pruebas químicas dentro de las cuales se encuentran: la prueba de conductividad eléctrica de la leche, el papel indicador de mastitis y la prueba de Whiteside, que sirven también para diagnosticar mastitis clínicas y subclínicas.

En esta segunda entrega se estará abordando lo referente a las pruebas biológicas, como son la prueba de California para mastitis (CMT), la prueba de Wisconsin para mastitis (WMT), el monitoreo de células somáticas y el diagnóstico bacteriológico por los métodos de aislamiento, cultivo, tinción, pruebas bioquímicas e identificación, así como al conteo de células somáticas por microscopia directa.

Finalmente, se hará referencia a los métodos de conteo electrónico celular, dentro de los cuales se encuentra el Bactoscan, Fossomatic y el Counter Coulter.

PRUEBAS BIOLÓGICAS

Dentro de éstas se encuentran: la prueba de California para mastitis, prueba de Catalasa, prueba de Wisconsin, prueba de CAMP y el monitoreo de células somáticas, así como el diagnóstico bacteriológico por los métodos de aislamiento, cultivo, tinción, bioquímica e identificación.

Prueba de California para Mastitis (CMT)

La Prueba de California para Mastitis (CMT, por sus siglas en inglés) ha sido empleada durante décadas y sigue siendo la prueba más utilizada a nivel de campo para el diagnóstico de mastitis en el ganado bovino lechero.

Es una prueba sencilla que es útil para detectar la mastitis subclínica por valorar groseramente el recuento de células de la leche. No proporciona un resultado numérico, sino más bien una indicación de si el recuento es elevado o bajo, por lo que todo resultado por encima de una reacción vestigial se considera sospechoso.

Pasos a seguir para la realización de la Prueba de California para Mastitis:

• Se desecha la leche del preordeño (Figura 7).
• Se ordeñan uno o dos chorros de leche de cada cuarto en cada una de las placas de la paleta (Figura 8). Ž Se inclina la paleta de modo que se desecha la mayor
  parte de esta leche.
• Se añade a la leche un volumen igual de reactivo (Figura 9).
• Se mezcla el reactivo y se examina en cuanto a la presencia de una reacción de gelificación (Figura 10). Antes de continuar con la vaca siguiente se debe enjuagar la placa.
• Se añade a la leche un volumen igual de reactivo (Figura 9).
• Se mezcla el reactivo y se examina en cuanto a la presencia de una reacción de gelificación (Figura 10). Antes de continuar con la vaca siguiente se debe enjuagar la placa.

Los resultados pueden ser interpretados en cinco clases (Figura 11): desde el resultado negativo en el que la leche y el reactivo siguen siendo acuosos, hasta el recuento de células más elevado en el que la mezcla de la leche y el reactivo casi se solidifican. Esto se determina en relación a la reacción de gelificación (Cuadro 2).

La prueba consiste en el agregado de un detergente a la leche, el alquil-aril sulfonato de sodio, causando la liberación del ADN de los leucocitos presentes en la ubre y éste se convierte en combinación con agentes proteicos de la leche en una gelatina.

A mayor presencia de células se libera una mayor concentración de ADN, por lo tanto mayor será la formación de la gelatina, traduciéndose en nuestra lectura e interpretación del resultado como el grado más elevado de inflamación.

Es decir, permite determinar la respuesta inflamatoria con base en la viscosidad del gel que se forma al mezclar el reactivo (púrpura de bromocresol) con la misma cantidad de leche en una paleta con cuatro pozos independientes permitiendo evaluar cada cuarto independientemente.

Desafortunadamente esta prueba es muy subjetiva y tiene que hacerse al lado de la vaca durante el ordeño (lo que interfiere con el manejo del ordeño).
La Prueba de California es un método de diagnóstico que posee una sensibilidad del 97% y una especificidad del 93%. Sus ventajas principales son:

Es una técnica muy sensible y se puede utilizar tanto en una muestra de cuartos, como una muestra del tanque enfriador. En una muestra de tanque, los resultados de grado 2 y 3, indican un alto porcentaje de vacas infectadas.

El material extraño no interfiere con la prueba (pelo u otro material).

La prueba es simple y no requiere de equipo costoso.

La paleta es fácil de limpiar después de cada uso.

A pesar de sus ventajas, la técnica presenta los siguientes inconvenientes:

Los resultados pueden ser interpretados de forma variable, entre los individuos que realicen la prueba, por lo que resulta necesario uniformizar el criterio de casos positivos y su categorización en grados.

Pueden presentarse falsos positivos en leche de animales con menos de diez días de paridos o en vacas próximas a secarse.

La mastitis clínica aguda da resultados negativos, debido a la destrucción de los leucocitos por las toxinas provenientes de los microorganismos presentes.

Figura 11. Interpretación de los resultados de la Prueba de California.​

Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT)

La Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT), fue diseñada para el uso en el laboratorio, y es utilizada para estimar el contenido de células somáticas de muestras de leche fresca mezclada o leche de tanques de enfriamiento, así como para muestreo de vacas individuales. Se utiliza una solución similar a la que se emplea con la prueba de California (CMT), pero en contraste con esta última, los resultados se miden cuantitativamente dependiendo de la viscosidad, no cualitativamente o de estimarla a ojo de buen cubero como en la CMT.

La técnica consiste en utilizar un tubo graduado en milímetros en donde se depositan 2 ml de leche y una mezcla de 2 ml de reactivo para CMT con agua destilada (1:1) ambas a temperatura ambiente. Enseguida se agita durante 10 segundos, horizontalmente y de izquierda a derecha. Se deja reposar 10 segundos y posteriormente se invierten los tubos durante otros 10 segundos.

Una vez transcurrido el tiempo, se procede a realizar la lectura en el tubo por debajo de la espuma que se forma (Figura 12). Los resultados se relacionan con la escala graduada en mililitros del tubo y su valor de células somáticas, empleando para su interpretación una tabla específica para la prueba (Cuadro 3).

Figura 12. Procedimiento Wisconsin WMT para el diagnóstico de la mastitis subclínica.

Los rebaños con una puntuación baja entre 3 y 12 están en condiciones buenas a regular, mientras que los rebaños con puntuaciones superiores a 12 requieren de atención inmediata.

Monitoreo del conteo de células somáticas

Con el nombre de células somáticas se designa a las células del propio organismo. Por tanto, las células somáticas son células corporales. Éstas pasan a la leche procedente de la sangre y del tejido glandular. El contenido de células somáticas en la leche nos permite conocer el estado funcional y de salud de la glándula mamaria en periodo lactante; debido a su estrecha relación con la composición de la leche, es un criterio de calidad muy importante.

La leche de una ubre sana presenta pocas células somáticas. En este caso se trata de células de tejido (células epiteliales) y células inmunes (neutrófilos polimorfonucleares, granulocitos, macrófagos, linfocitos). El porcentaje de los diferentes tipos de células somáticas en la leche de las glándulas mamarias sanas es como sigue: a) macrófagos (60%); b) linfocitos (25%); y c) neutrófilos o leucocitos polimorfonucleares (15%).

De todas las células de la leche de un cuarto infectado, aproximadamente el 99% serán leucocitos, mientras que el resto 1% serán células secretoras que se originan de los tejidos de la ubre. Juntos esos dos tipos de células constituyen la cuenta de células somáticas (CCS) de la leche que comúnmente es expresada en mililitros (ml).

El conteo de células somáticas (CCS) es la medición más ampliamente utilizada para supervisar en estado inflamatorio de las glándulas mamarias, y puede ser realizada en la leche de: 1. cuartos individuales; 2. vacas individuales; 3. el hato completo; 4. un grupo de hatos.

La infección intramamaria es el principal factor causante de cambios en la CCS en la leche. Cuando los microorganismos causantes de mastitis invaden un cuarto de la ubre y empiezan a multiplicarse o cuando el número de estos aumenta significativamente en un cuarto infectado, el organismo de la vaca tiende a reclutar leucocitos para combatir a dichos microorganismos causantes de la mastitis.

Figura 13. Procedimiento de siembra, incubación e identificación.

Las glándulas mamarias que nunca se han infectado normalmente tienen CCS de 20,000 a 50,000/ml. En grandes poblaciones de vacas, 80% de los animales no infectados tendrán un CCS menor de 200,000/ml y 50% menor de 100,000/ml. Una razón de las cuentas ligeramente elevadas en animales no infectados es que algunos cuartos tuvieron una infección previa de la cual no se han recuperado totalmente.

Según Philpot, (2001) datos obtenidos de numerosos estudios, señalan que la mayoría de las vacas con una CCS menor de 200,000/ml probablemente no están infectadas, y que la mayoría de esas vacas con cuentas mayores de 300,000/ml probablemente están infectadas. Mientras que aquellas con una CCS entre 200,
00 y 300,000/ml son difíciles de interpretar.

En base a lo anteriormente expuesto, cabe señalar que el registro ordenado de los resultados de las pruebas de monitoreo mensual de vacas individuales nos va a proporcionar información muy útil para el manejo del hato, para el ganadero, y el veterinario. Aunque estas pruebas de monitoreo no diagnostican la causa o tipo de infección o si hay una lesión presente, si alertan al ganadero y al veterinario de que un problema se está desarrollando, por lo que se debe poner mucha atención al respecto.

Pruebas bacteriológicas

Los cultivos en laboratorio son necesarios para identificar los organismos específicos que se encuentran comprendidos en un caso clínico de mastitis y para distinguir los animales sanos de aquellos que presentan un caso subclínico. La fidelidad de los resultados de laboratorio depende de los cuidados sanitarios que se tengan durante la toma de muestras y su manipulación posterior.

Al extraer muestras se deben descartar dos o tres chorros de leche y se deben asegurar que las tetas estén bien limpias y que se han frotado los extremos de las mismas durante algunos segundos con un algodón húmedo con 70% de alcohol, antes y después de recoger las muestras en un recipiente esterilizado se deben congelar hasta entregarlas al laboratorio. Los procedimientos bacteriológicos son esenciales para la selección de los agentes terapéuticos que tienen especificidad para el germen presente.

Conteo de células somáticas por microscopia directa

El recuento microscópico directo de células somáticas de la leche denominado también, método óptico, si bien es de referencia, actualmente es de poca utilidad cuando se trata de un gran número de muestras y se debe trabajar con una metodología más rápida. Sin embargo, aún mantiene su utilidad para los trabajos de investigación.

Figura 14. Procedimiento de microscopia directa

El método tradicional de recuento de células somáticas es el “recuento directo” por microscopio utilizando un agrandamiento de 500x. Es un ensayo cuantitativo de laboratorio por el cual se examinan bajo el microscopio utilizando frotis teñidos de leche problema y se cuenta el número de células somáticas (Figura 14). Los tanques de leche a granel con más de un millón de células por mililitro de leche, sugieren que por lo menos el 40% de las vacas de la explotación tienen mastitis.

Los recuentos de menos de un cuarto de millón, indican que no más del 10% de las vacas están clasificadas bajo el número 2 de la escala de calificación en la prueba de California. Este método es más preciso, pero también el que consume más tiempo y requiere además equipo costoso. En la Federación Internacional de Leche existe una descripción del método “A”: Se coloca la leche en una placa de vidrio y una persona cuenta las células visibles en el microscopio. Sin embargo, es difícil que una persona alcance a contar más de 10 muestras por hora.

Es por eso que los procedimientos directos de recuentos por microscopio deben considerarse anticuados, ya que no pueden utilizarse para analizar un gran número de muestras en poco tiempo y con alta precisión.

Figura 15. Aparato Counter Coulter.

MÉTODOS DE CONTEO ELECTRÓNICO CELULAR

Los métodos electrónicos tienen en la actualidad una aplicación universal, sobre todo en laboratorios de control lechero o dedicados al diagnóstico o investigación de la mastitis, utilizándose aparatos de recuentos celulares como el Bactoscan, Fossomatic (Foss Electric, Dinamarca) y el Counter Coulter (Coulter, Inglaterra).

Método Bactoscan

Este método se utiliza para obtener un recuento total de las bacterias en la leche cruda. Es un aparato electrónico y rápido que procesa hasta 80 muestras por hora. Las bacterias son aproximadamente diez veces menores que las células somáticas.

Método fluoro-opto-electrónico (Fossomatic) y Counter Coulter

Estos dos aparatos poseen alta correlación con la microscopia óptica, por lo que proporcionan una medida segura en el recuento de células somáticas. Sin embargo, se pueden presentar variaciones en el recuento en las mismas muestras cuando se realizan con los dos aparatos debido a la diferencia de operación de cada uno de ellos.

El Fossomatic basa su cálculo en la tinción fluorométrica del material nuclear, mientras que el Counter Coulter cuenta el número de impulsos eléctricos resultantes de las partículas que pasan entre dos electrodos (Figura 15). Es decir, cuenta partículas de un diámetro determinado, que para el caso serían las células, pero en el rango de recuento entrarían otras partículas, aumentando ligeramente el valor en comparación con el Fossomatic.

El Fossomatic consiste en el filtrado de una solución de leche mezclada con detergente (Triton X-100 EDTA) a través de una membrana con poros finos. Un procedimiento colorimétrico basado en la reacción con el ADN de las células es entonces utilizado para determinar el contenido de ADN que está relacionado directamente con el número de células presentes en la muestra inicial.

Procedimiento: Se coloca una muestra de leche de 5 ml de leche a 40oC. En el Fossomatic se tiñen las células somáticas con un colorante fluorescente para obtener una reacción sólo con el ADN de las células. Es por eso que las partículas sucias y los glóbulos de los lípidos no se suman al número de las células somáticas. La muestra pasa frente a una luz especial y un detector registra cada célula somática. Entre cada muestra el aparato limpia su sistema de flujo para evitar el efecto del arrastre de una muestra a otra. Todas estas funciones son automáticas.

Las funciones principales del operario son las de preparar los reactivos cada mañana, colocar los portamuestras en la cinta transportadora del aparato y esperar en segundos los resultados del número de células somáticas. Asegurar que siga existiendo una buena relación entre los resultados del aparato y los resultados del método tradicional, analizando unas muestras con ambos métodos (por ejemplo cada semana).

Son obvias las ventajas de este equipo electrónico de recuento. Es independiente del operario, mide con alto grado de precisión y exactitud, y además da la posibilidad de registrar los datos automáticamente.

La desventaja de este equipo es su alto costo (44,000.00 a 176,000.00 dólares) sin embargo, al estar el equipo preparado para analizar un gran número de muestras, el costo por muestra es mucho más bajo que otros métodos utilizados para el recuento de células somáticas (Figura 16).

Figura 16. Método fluoro-opto-electrónico (Fossomatic).

En síntesis, se puede decir que el Fossomatic es un contador específico de ADN basado en un principio óptico de fluorescencia. Debido a que el bromuro de ethidio penetra en la célula y forma un complejo fluorescente con el ADN nuclear, cada célula produce un pulso eléctrico que se amplifica y se registra. La automatización de este proceso significa que pueden analizarse un gran número de muestras por hora en los laboratorios de pruebas de leche. En la mayoría de los casos, el Fossomatic utiliza leche fresca o conservada. Aunque han sido muy pocos los estudios que se han llevado a cabo con leche congelada, ésta puede ser útil en caso de una avería en el equipo de CCS, o en los protocolos biológicos o bacteriológicos para muestras de leche congelada.

CONCLUSIÓN

Las pruebas y métodos para realizar el diagnóstico de la mastitis bovina son un recurso o herramienta que permite identificar el tipo de infección ya sea de forma subclínica o clínica que puede presentarse dentro de un hato lechero, el método que se elija para determinar las pruebas será esencial para tener un diagnóstico más preciso.
Darle a conocer a los veterinarios, técnicos y a los ganaderos este tipo de pruebas y métodos, ayuda a que la enfermedad no se disemine más entre las vacas en los establos, permitiendo tomar las medidas necesarias a tiempo contra la mastitis.

Es cierto que no todas las pruebas y métodos aquí mencionados son muy eficientes, por lo que se debe considerar con detalle cuál se encuentra entre las condiciones económicas del productor y la eficacia de la prueba o método a utilizar.

Artículo publicado en Entorno Ganadero Junio-Julio 2018