III. TÉCNICAS MOLECULARES.
Mc María Hortensia Cepeda E.
Coordinación de Ciencia Animal.
Departamento de Ciencias Médico Veterinarias
Universidad AutónomaAgraria Antonio Narro. Unidad Laguna.
Torreón, Coahuila.
[email protected]
Mvz Ana Gabriela Gaeta R.
Coordinación de Ciencia Animal.
Departamento de Ciencias Médico Veterinarias
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.
Unidad Laguna.
Mc Ramón Alfredo Delgado G.
Coordinación de Ciencia Animal. Departamento de Ciencias
Médico Veterinarias Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.
Unidad Laguna.
RESUMEN
La criptosporidiosis es una infección producida por parásitos protozoarios del género Cryptosporidium, los cuales pueden ser ingeridos en agua o alimento contaminado, siendo capaces de producir diarrea en diversos vertebrados, incluyendo al hombre. Se han identificado C. parvum, C. ryanae, C. parvum y C. meleagridis como los principales causantes de la criptosporidiosis en bovinos y C. hominis como el principal causante de la “diarrea del viajero” en humanos. Los signos característicos son diarrea acuosa, inapetencia, fiebre, deshidratación, pobre condición corporal y depresión.
En individuos inmunocompetentes la mortalidad es baja y la infección se autolimita de 9 a 15 días aproximadamente. Generalmente, los animales destetados y los adultos infectados no manifiestan síntomas de la enfermedad, pero pueden excretar ooquistes que contaminan el medio. La importancia de esta infección radica en la facilidad de su contagio siendo un tema muy importante en las explotaciones pecuarias por su alto costo en tratamientos prolongados y las importantes pérdidas que conllevan la baja tasa de ganancia de peso y conversión alimenticia en animales neonatos. En humanos afecta principalmente a niños pequeños, ancianos y a personas con inmuno supresión. Es considera como una enfermedad definitoria del VIH, en los cuales, la diarrea es severa y es capaz de provocar la muerte en la mayoría de los casos. Para su diagnóstico, es necesario realizar la identificación del parásito mediante pruebas de laboratorio, de las cuales existe una variedad de ellas, desde las pruebas más sencillas que pueden ser elaboradas en un laboratorio estándar, hasta las pruebas más especializadas que sólo pueden ser llevadas a cabo con equipo especializado y personal capacitado.
INTRODUCCIÓN
La criptosporidiosis es una enfermedad parasitaria provocada por Cryptosporidium spp., pertenecen al phylum Apicomplexa, parásito intracelular que infecta a gran cantidad de mamíferos como aves, reptiles, anfibios y humanos, entre otros. Es considerada como una de las principales causas de diarrea neonatal en bovinos (Angus, 1990). Es cosmopolita y de gran importancia tanto en países desarrollados como no desarrollados, ya que afectan principalmente a individuos con sistema inmunológico comprometido, siendo capaz de provocar la muerte del hospedador (Domenech y col., 2011, Kurniawan y col., 2013). Los protozoarios del género Cryptosporidium son patógenos clínicamente importantes por causar enfermedades gastrointestinales (Cacciò y Widmer, 2014). Cryptosporidium es un parásito intracelular obligado, por lo tanto sólo necesita de un único huésped (monoxeno) para completar su ciclo de vida y su distribución puede variar por temporada y geográficamente (Borowski y col., 2008).
Los patógenos entéricos son ingeridos por agua contaminada y alimento, y pasan a través del tracto gastrointestinal, una vez establecida en el huésped, la infección se dispersa a nuevos huéspedes por una eliminación posterior. Para el diagnóstico de esta enfermedad, están disponibles una gran variedad de métodos, para la identificación del agente, Cryptosporidium spp., incluyendo microscopía y técnicas inmunológicas y de diagnóstico molecular. Durante dos décadas, las herramientas de la biología molecular se han desarrollado para identificar y diferenciar el parásito, a nivel de especie/genotipo y niveles de subtipos (Xiao y Ryan, 2004; Cacciò, 2005). Sin embargo, las técnicas inmunológicas y moleculares son más complejas y costosas, haciendo los métodos menos prácticos para la detección, especialmente en entornos con escasos recursos económicos. Sin embargo tienen mejor sensibilidad y mayor especificidad (Morgan y col., 1998; Siddons y Chapman, 1992).
La materia fecal de animales y humanos es fuente de gran cantidad de microorganismos, que se dispersan directamente o a través de lluvias por escurrimiento de tierras agrícolas, suburbanas y urbanas, aguas residuales de los ríos, arroyos, estuarios y aguas costeras, contaminando además el mar y sus habitantes (EFSA, 2012), convirtiendo esto en una fuente sumamente importante de propagación de la infección, siendo un riesgo para la Salud Pública. Las escasas características patognomónicas de la infección por Criptosporidiosis dificultan su diferenciación entre otras patologías diarreicas, por lo que debe confrontarse con otras posibles etiologías de diarrea (Chacín-Bonilla, 1995). C. parvum es mayormente encontrada en bovinos jóvenes de 2 meses de edad, donde C. bovis y C. ryanae son las especies más comunes en bovinos de mayor edad y jóvenes. C. andersoni es principalmente encontrado en ganado joven y adulto (Robertson y col., 2014).
La infección puede ser diagnosticada antemortem por el análisis de heces y postmortem, mediante un corte histológico de una sección de intestino. La Criptosporidiosis se diagnostica al demostrar la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. en muestras de heces, o la identificación de esquizontes y gametocitos en biopsias de tejido intestinal (Chacín-Bonilla, 1995). Sin embargo, la mayoría de los métodos de diagnóstico se basan en la detección de los ooquistes en heces por microscopía. Estos métodos son menos invasivos (Trotz-Williams y col., 2005).
Las muestras de heces directas o concentradas, son teñidas y examinadas bajo el microscopio para identificar a los parásitos en sus formas quísticas. En la actualidad están disponibles una variedad de métodos para la identificación de Cryptosporidium spp., desde pruebas diagnósticas sencillas como la microscopía, hasta técnicas más especializadas y sensibles que requieren equipo más especializado como las técnicas inmunológicas y especialmente, el diagnóstico molecular (Haque y col., 2007).
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO:
I. MICROSCOPÍA.
La popularidad de esta técnica radica en su simplicidad, ya que no requiere nada más que un microscopio, el agente y para algunas técnicas, tinciones fácilmente disponibles. La microscopía ha sido el pilar de las herramientas de diagnóstico por décadas, incluso aunque existan otras técnicas los resultados aún requieren confirmación por microscopio ya que los nuevos diagnósticos carecen de estandarización (Riccardi y Momar, 2015). No obstante, algunos autores indican que resulta muy complicada la identificación de los ooquistes por sus características morfológicas y transparencia, y por la presencia de impurezas y desechos fecales, particularmente en diarrea severa.
TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN DE OOQUISTES:
En 1982, Pavlásek demostró que los ooquistes excretados en heces de animales infectados, pueden ser aislados utilizando métodos de flotación por centrifugación. Esto es muy importante para la detección de este parásito en animales infectados y para estudiar su distribución en diferentes condiciones. El aislamiento de los ooquistes de heces es útil para elucidar el ciclo de vida de Cryptosporidium en base a las infecciones experimentales y su participación en la muerte de los animales, especialmente los becerros.
• TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen modificada es clásicamente llevada a cabo por teñir un delgado frotis de materia fecal, fijado con metanol, con una solución de carbol-fucsina sin diluir por lo menos 15 minutos. Después, la laminilla es enjuagada con agua corriente y colocada en una solución de alcohol-ácido para remover el tinte y las estructuras ácido resistentes van a resistir la decoloración. Después de un nuevo enjuague, se tiñe con azul de metileno, el cual le dará un fondo de contraste entre el material y las estructuras ácido-resistentes. Se realiza un último enjuague con agua corriente y se deja secar al aire, puede ser examinada utilizando el objetivo 10X y el objetivo de aceite de inmersión de magnificación 100X. (Henriksen y Pohlenz, 1981; Casemore y col., 1985).
• TINCIÓN KINYOUN
La técnica Kinyoun es muy similar a técnica Ziehl-Neelsen, pero con tres diferencias básicas: no se calienta el colorante principal (no se utiliza calor como segundo mordiente), el ácido utilizado para decolorar es más débil y no se decolora con alcohol. Las coloraciones de Ziehl-Neelsen y de Kinyoun tienen la misma sensibilidad, especificidad y contraste; pero ésta última (método frío Kinyoun) requiere menos tiempo y su ejecución más sencilla (Velazco, 1995). Por lo tanto, la única ventaja que ofrece la técnica de Kinyoun, en comparación con Ziehl-Neelsen, es que puede llevarse a cabo en un menor tiempo.
• TINCIÓN GIEMSA
La técnica de tinción Giemsa es una modificación de la coloración de Romanowsky, resulta de la combinación de eosina y azul de metileno en una misma solución. Esta técnica es utilizada en los laboratorios de hematología para demostrar la diferencia entre el núcleo y el citoplasma de las distintas células sanguíneas y en microbiología, para la diferenciación intra y extracelular de parásitos en sangre circulante y además es útil para la observación de levaduras (Díaz y col., 1955). Este método presenta ciertas dificultades cuando es utilizado para diagnóstico rutinario. Los ooquistes tienen poca afinidad por la tinción Giemsa y suelen perderse en el fondo, mezclados con proteínas u otros materiales presentes en los frotis fecales, por lo tanto, pueden no ser detectados sobre todo cuando son pocos ooquistes. Además, los ooquistes de Cryptosporidium pueden confundirse con levaduras en la tinción de Giemsa por su tamaño y color similar (Angus y col., 1981).
• TINCIÓN DE HEINE
Para la técnica de tinción negativa de Heine, la muestra de heces es mezclada con la misma porción de solución de carbol-fucsina sin diluir en un portaobjetos. Se hace un frotis delgado, se deja secar al aire y se examina utilizando el objetivo 10X y el objetivo de aceite de inmersión, a una magnificación 100X. En esta tinción, los ooquistes de Cryptosporidium aparecen sin teñir, fuertemente refractivos, como estructuras redondas u ovaladas de 3 a 6 micrómetros de diámetro. Las estructuras internas son ligeramente visibles, como manchas oscuras dentro del ooquiste. Esta técnica tiene una limitante, las laminillas deben ser examinadas 15 minutos después de haber sido secadas al aire (Heine, 1982). Este lapso de tiempo puede prolongarse a 30 minutos si se utilizan muestras que hayan sido fijadas en formalina al 10%, anterior a la tinción. Si la laminilla no es examinada en 15 a 30 minutos, los ooquistes se desecan y se volverán menos visibles. Un microscopio es indispensable para el contraste de fase para su observación (Chartier y col., 2002), ya que el contraste de fase aumenta la especificidad y la sensibilidad, pero los ooquistes pueden ser aun reconocidos sin el contraste de fase. Para aumentar la sensibilidad de la técnica de tinción negativa, se recomienda agregar una gota de aceite a la laminilla y colocar un cubreobjetos. Haciendo lo anterior, la preparación puede ser observada utilizando el objetivo 10X y una magnificación de 100X, obteniendo buenos resultados (Heine, 1982).
• TINCIÓN KÖSTER
Gracias a la alta afinidad de la tinción por los ooquistes de Cryptosporidium, estos se observan de un color rojo pálido contra un fondo verde; tiene la ventaja sobre la técnica Ziehl- Neelsen, ya que los esporozoitos pueden ser visualizados en el interior del ooquiste. Para realizar esta técnica, es necesario hacer un frotis de la muestra de heces y permitir secar al aire, posteriormente se fija en alcohol metílico de 2 a 5 minutos, se deja secar en un mechero por algunos segundos hasta que el alcohol se queme. Posteriormente se tiñe por 5 minutos con una mezcla de 2 partes de una solución acuosa saturada de safranina más 5 partes de solución KOH al 5,6%. Se lava con agua y se diferencia en H2SO4 al 1% por 10 segundos, se lava con agua, se sumerge en solución acuosa de Verde de Malaquita al 5% por 10 a 15 segundos y se realiza un último lavado con agua (Castro y Guerrero-Bermúdez, 2004). Respecto a las opiniones sobre la técnica Köster, la literatura menciona que es mejor que la tinción de Ziehl-Neelsen, ya que provee una mejor diferenciación de las estructuras internas del ooquiste (esporozoitos) gracias a su alta afinidad, ofrece una coloración roja de los ooquistes sobre un buen fondo de contraste verde, además no tiñe levaduras ni hongos lo que facilita la identificación y requiere menos tiempo para su realización
II. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS.
• INMUNOFLUORESCENCIA
Las pruebas de Inminofluorescencia pueden utilizarse para detectar anticuerpos o la presencia de un patógeno. En ambos casos la reacción finaliza mediante la adición de un anticuerpo conjugado a una sustancia fluorescente, habitualmente fluoresceína. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretación tiene un alto grado de subjetividad. Las pruebas de inmunofluorescencia presentan dos variantes, directa (detección de antígeno) e indirecta (detección de anticuerpo) (Cañavate y col., 2009).
La detección de anticuerpos de Cryptosporidium puede realizarse por medio de la inmunofluorescencia indirecta (IFI). La prueba de IFI se ha utilizado para evaluar otros ensayos de diagnóstico, sin embargo, sólo puede ser realizada en laboratorios especializados, por personal calificado para evitar que los resultados puedan ser interpretados de manera subjetiva. Además, la prueba IFI es lenta, con cierta dificultad de analizar muestras múltiples de manera simultánea, y no es una técnica sencilla de realizar en un laboratorio estándar. Otras desventajas que presenta esta prueba diagnóstica es que detecta anticuerpos de infección y exposición. Por esta razón necesitan desarrollarse otros ensayos serológicos para el diagnóstico de infección por Cryptosporidium (Cañavate y col., 2007).
• DETECCIÓN DE ANTÍGENOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. POR INMUNOENSAYO (ELISA).
El copro-antígeno Elisa es una prueba sencilla para antígeno Cryptosporidium y esto sugiere que puede ser utilizado como única prueba en lugar de las técnicas convencionales de microscopio. También se sugiere que puede ser particularmente útil en laboratorios que no diagnostiquen Cryptosporidium comúnmente, en estudios epidemiológicos a falta de estandarización del diagnóstico y en situaciones donde el procesamiento de la muestra por lotes puede ser crucial (Brook y col., 2008). Tiene una sensibilidad del 100% (Direkel y col., 2008). En ELISA, se busca la presencia de los antígenos de los ooquistes en heces. Dependiendo del kit comercial, los coproantígenos de Cryptosporidium se capturan y se desarrollan con una mezcla de anticuerpos mono y policlonales (Rojas, 1995).
III. TÉCNICAS MOLECULARES.
• AMPLIFICACIÓN DE UNA PEQUEÑA SUBUNIDAD DEL GEN ARN RIBOSOMAL (SSU RRNA).
Se utiliza un protocolo de PCR tiempo final anidado en dos etapas para amplificar un fragmento de ~430 bp del gen SSU rRNA usando cebadores 5´-GTGGCAATGACGGGTAACGG -3´ y 5´- CAGGACATCTAAGGGCATCA -3´ para el PCR primario, y 5´- AAGCTCGTAGTTGGATTTCTG -3´ (CPB-DIAGF) y 5´-TAAGGTGCTGAAGGAGTAAGG -3´ (CPBDIAGR) para el PCR secundario. La PCR se lleva a cabo en un volumen de 25 μL conteniendo 2.0 μL (10 ng/μL) de ADN genómico, 2.5 μL 10× PCR buffer, 1.0 μL MgCl2 (50 mM), 0.2 μL (5 IU/μL) Taq DNA polimerasa, 0.5 μL dNTP (10 mM), 1.0 μL (20 pmol/μL) de cada cebador de avance y retroceso y nucleasa libre de agua de hasta 25 μL. El primer paso del programa de PCR incluye 35 ciclos (94°C por 45 seg, 55°C por 30 seg y 72°C por 1 min), y el segundo paso de PCR incluye 40 ciclos (94°C por 30 seg, 55°C por 30 seg y 72°C por 1 min) usando el producto de ADN del primer paso como plantilla (Chen y Huang 2010).
CONCLUSIONES
Una de las limitaciones que existen para el monitoreo de este parásito, es que los métodos comúnmente usados para su detección, resultan muy complejos y costosos para su aplicación en análisis de rutina, lo que plantea la necesidad de la búsqueda de métodos más económicos y prácticos que permitan llevar a cabo su control y monitoreo. A nivel individual, un diagnóstico preciso no siempre es indispensable, ya que no afecta el curso de las medidas terapéuticas a tomar (rehidratación urgente, seguido de medidas higiénicas y tratamiento de soporte). Pero a nivel de hato, el diagnóstico es muy importante por el tratamiento y especialmente en la cuestión económica. En 1980, el método más fiable para el diagnóstico en medicina humana, era por escaneo o microscopía electrónica de transmisión de material de biopsia intestinal, identificando los ooquistes en diferentes etapas de desarrollo presentes en el borde de las células epiteliales intestinales. Sin embargo, la obtención de una muestra intestinal por biopsia y la microscopía electrónica, son métodos difíciles para uso rutinario en los laboratorios. La concentración fecal seguida de la técnica de tinción parece ser la alternativa más apropiada para un diagnóstico más costeable de la Criptosporidiosis. Los investigadores y profesionales deben de analizar varios criterios de importancia al contemplar la elección de los métodos de diagnóstico disponibles.
Deben los métodos en términos de costo, facilidad de uso, tiempo requerido para la preparación de la muestra, tiempo de identificación y facilidad de procesamiento de grandes cantidades de muestra. Si bien en principio, el diagnóstico molecular parece ser el más específico y fiable en cuanto a la detección de organismos, tiene también sus limitaciones. Así la extrema sensibilidad de estas pruebas, puede conducir con facilidad a resultados falsos positivos por la contaminación de la muestra. Haciendo una comparación de la literatura, podríamos concluir que la mejor técnica de diagnóstico hasta el momento es la PCR, ya que nos ofrece información rápida y sumamente específica sobre el agente que se investiga, ofreciendo información a nivel de especie, genotipo y subgenotipo, lo que la convierte en una prueba altamente sensible. Sin embargo, es una prueba costosa y requiere equipo de laboratorio más especializado y reactivos costosos. Resulta sumamente útil para comparar la genética de la población parasitaria hacia el hospedador, siendo necesaria una cantidad muy pequeña de muestra (microlitros) y sólo necesita algunos ooquistes para poder obtener un resultado positivo. No obstante, se requiere personal cualificado y por su gran exactitud y especificidad, es relativamente fácil contaminar la muestra y alterar el resultado.
LITERATURA CITADA
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Artículo publicado en Entorno ganadero
