Gutiérrez Pérez Oscar.
Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Porcina (CEIEPP)
FMVZ-UNAM. Jilotepec, Edo. de México.
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Introducción
La inseminación artificial (IA) porcina es una técnica de reproducción asistida de uso cotidiano. Los porcicultores requieren dosis de semen de calidad, con altos estándares de seguridad biológica, genética y fertilidad. En la búsqueda de prolongar el periodo de almacenamiento del semen porcino y dadas las complicaciones para la congelación de éste, se han diseñado diluyentes de extra larga duración para semen fresco-refrigerado (con almacenaje a 16°C) donde la mejor manera de mantener el potencial fertilizante de estas dosis es su correcto procesamiento y la utilización de agua, diluyentes y materiales de probada calidad. Esto nos lleva no sólo a aplicar mayor rigor en nuestros procesos de dilución y almacenaje, sino también a mejores técnicas de evaluación que nos permitan una predicción confiable de la fertilidad de las dosis elaboradas de un eyaculado. Sin embargo algunas de estas técnicas requieren de equipo costoso y de personal altamente calificado lo que las convierte en difícilmente aplicables en la mayoría de los centros de transferencia genéticos (también conocidos como laboratorios de procesamiento de semen y/o postas de sementales) de pequeño y mediano tamaño.
El objetivo del presente resumen es puntualizar errores críticos presentes en la rutina del procesado del semen, los avances y las expectativas que se han dado en los sistemas de almacenaje de semen y comentar sobre algunas técnicas de evaluación funcional de baja complejidad y costo, que pueden ser aplicadas con facilidad en cualquier laboratorio de elaboración de dosis para IA porcina.
Del mantenimiento de la Calidad Seminal almacenada
La concentración espermática por dosis dependerá del sistema de aplicación elegido. Actualmente la inseminación intrauterina (post-cervical) está ganando popularidad pues abarata costos sin problemas de retorno al estro post IA al permitir disminuir la concentración espermática requerida a la mitad. Sin embargo la IA convencional (cervical) sigue siendo la de primera elección. La concentración mínima requerida para una dosis fertilizante, ha cambiado en los últimos 20 años. Para la década de los 80 inseminábamos con una concentración de 4000 millones en dosis de 100 ml, hoy en día podemos disminuir la concentración hasta los 1700 millones en volúmenes de 80 ml sin comprometer la fertilidad. Como sea, la preferencia en nuestro país, ofertada por las principales casas de genética líquida se mantiene en los 3000 millones en un volumen de 80 ml, lo que asegura no sólo la fertilidad sino también el tamaño de camada.
A este respecto debemos mencionar que los principales errores al medir la concentración son el mal uso del hematocitómetro (generalmente una cámara de Neubauer) y las diluciones incorrectas. La dilución debe hacerse en un medio isosmótico (300 mosm) para evitar alteraciones espermáticas. El agua corriente tiene muchas sales y la hace hiperosmótica, el agua desionizada no tiene sales y la hace hiposmótica el resultado cabezas hinchadas o deshidratadas y colas enrolladas por estrés osmótico. La solución isosmótica más fácil de conseguir en campo es la Solución salina fisiológica que podemos comprar en la farmacia y agregarle 4 ml de formol por litro, para lograr la fijación celular y lograr que los espermatozoides dejen de moverse y permitir el conteo. Soluciones de nitrato o de fosfatos bufferados son aún mejores que la solución salina.
La utilización de cubreobjetos “comunes”, también provocan errores en el tamaño de la gota a evaluar. Los hematocitómetros deben cubrirse con cubreobjetos para hematocitómetro que son más gruesos y pesados y que tienen un proceso de elaboración mejor supervisado, lo que permite el volumen correcto de la gota en la cámara de conteo. La esponja que acompaña las cámaras dentro de la cajita plástica donde viene cuando la compramos no es un absorbente de impactos, es una cama para crear una cámara húmeda que permite la precipitación celular. De esta manera al remojar esta esponja con agua tridestilada logramos que todos los espermatozoides se precipiten por la humedad ambiental generada dentro de la cajita plástica y las células decantadas se encontrarán en el mismo plano evitando la engorrosa tarea de realizar ajustes con el micrométrico del microscopio en plena evaluación.
El pH es un marcador que pocos laboratorios interpretan de manera correcta. La idea de tomar el pH del eyaculado antes de la dilución debería abandonarse. El pH realmente importante es el del semen diluido pues será el que permita un tiempo de almacenaje más prolongado. Los mejores resultados se han obtenido con un pH de 7.3 que mantiene las características cinéticas de los espermatozoides almacenados. Para lograr mantener un pH adecuado no olvidemos preparar el diluyente por lo menos con dos horas de anticipación a su utilización, permitiéndole una correcta estabilización. De manera personal yo recomiendo preparar los diluyentes con agua caliente (no más de 40°C) para que la dilución sea más sencilla pues desaparecen los grumos que se forman al utilizar agua fría, dejarlos que lleguen a temperatura ambiente y posteriormente guardarlos en refrigeración hasta el día de su utilización. Una vez preparados los diluyentes comerciales actuales mantienen en refrigeración todas sus características por una semana.
Un interesante punto que aún está en investigación es la rotación de las dosis dos veces o más por día. Este manejo surge de la idea de que los espermatozoides se precipitan hacia el fondo del envase favoreciendo que los que quedan más abajo pierdan contacto con el medio de dilución. Si bien esto parece lógico la rotación de las dosis parece disminuir el pH y por lo tanto la vida de anaquel de la dosis seminal, por lo tanto se sugiere rotar gentilmente las dosis sólo una vez al día y abandonar la rotación que se realizaba hasta tres veces al día.
Por otro lado la clásica premisa de la colección selectiva de la nombrada “Fracción rica” también ha perdido fortaleza. Existe un fenómeno relacionado con la “vejez” del espermatozoide almacenado conocido como reacción acrosomal inducida o falsa capacitación por tiempo de almacenaje. Este fenómeno vuelve a los espermatozoides incapaces para interactuar con los ovocitos de manera adecuada, por lo tanto es un concepto que debemos tomar en cuenta en el análisis microscópico pues un semen con siete días de almacenaje puede mantener una motilidad individual aceptable pero carecer de la maquinaria que le permita atravesar las envolturas del ovocito de manera adecuada, es decir “no todo lo que se mueve fertiliza” y este concepto lo retomaremos en este mismo escrito más adelante.
En la actualidad sabemos que las proteínas (PSP I, PSP II, espermadhesinas, antiaglutininas, etc.) y minerales (ej. Zinc) adicionados al plasma seminal por las glándulas accesorias del verraco no sólo funcionan como factores descapacitantes que favorecen el tiempo de almacenaje sin reacciones acrosomales inducidas o falsas capacitaciones, sino que también son factores de protección que estabilizan el núcleo (Zn), mantienen el pH y disminuyen la sensibilidad espermática a los cambios de temperatura. Por lo anterior la tendencia actual es la de recolectar el eyaculado completo sin la distinción clásica de las tres fracciones (Figura 1).
La Bioseguridad es otro tema sobre el que los productores toman cada día más conciencia. Si bien en el caso de los virus las medidas de seguridad son tomadas mediante el correcto manejo de zonas blancas y grises, el aislamiento de las instalaciones, el cuarentenado de los animales (con su doble monitoreo serológico antes de su incorporación), manejo todo dentro-todo fuera, etc. Los compradores cada vez con mayor frecuencia monitorean mediante PCR algunas de las dosis que compran para asegurarse de la limpieza del CTG. Ante esta situación debemos intensificar la vigilancia sobre nuestros protocolos de bioseguridad para evitar contaminaciones virales en nuestros sementales.
El caso de las enfermedades bacterianas transmitidas por semen es un rubro aparte, la adición de antibióticos en el semen no es la panacea para su control. Recordemos la capacidad bacteriana de crear resistencia a estos fármacos. Para ello es necesario extremar las medidas higiénicas, monitoreando el agua que utilizamos en la elaboración de diluyentes, realizar hisopados de las aéreas de alojamiento y colección de los sementales para verificar la adecuada desinfección de las mismas, etc.
Una práctica rutinaria que sin embargo parece aún no generalizada es la limpieza prepucial interna. La limpieza externa se realiza de manera escrupulosa, pero el lavado ventral, el vaciado por masaje del divertículo prepucial y la limpieza externa del prepucio no son suficientes para controlar la proliferación bacteriana. En algunos centros se conforman con exprimir el divertículo prepucial esperando salga todo el orin y el esmegma (detritus celulares y otras secreciones). Recordemos que el prepucio del cerdo es bastante más largo que la parte libre del pene a la que aloja. En el techo de la cavidad prepucial se sitúa un estrecho orificio por el que se accede al divertículo prepucial. Dicho divertículo lo forman dos amplias cavidades que acumulan el esmegma y en él se reproducen fácilmente las bacterias que causan el mal olor. Un ejemplo el Eubacterium suis, un patógeno gram+ que se ha relacionado con cistitis en cerdas y machos.
Para la limpieza interna se recomienda introducir en el divertículo a través del orificio prepucial un volumen de entre 30 a 40 ml de solución antibiótica (nitrofurazona o clortetraciclina líquida) dejarlo actuar y volver a exprimir el divertículo. Esto disminuye la carga bacteriana y también de manera considerable el olor a verraco que impregna al termo y al trabajador durante la colecta, inclusive animales bien manejados no presentan olor o bien es escaso (Figura 2).
Otra opción igual de funcional es el uso de soluciones sobresaturadas de bicarbonato de Na en agua destilada, lo que cambia el pH disminuyendo la proliferación bacteriana. En este segundo caso hay que hacer dos lavados más con agua destilada para retirar los residuos de bicarbonato del divertículo. Esta práctica disminuye la contaminación del eyaculado por escurrimiento.
Preservación alterna: Congelación, liofilizado y encapsulamiento
La congelación permite la preservación de semen por tiempo indefinido que puede ser de meses hasta años, favorece en gran medida la distribución de las características deseables para una rápida mejora genética, ya que el semen congelado es fácilmente transportable a través de largas distancias, sin importar que las hembras estén o no en estro al momento de la recepción. Por otra parte permite el uso de dicho material genético aun después de que el macho donador haya muerto, se encuentre enfermo o deba ser desechado del hato reproductor. Un ejemplo del potencial de aplicación del semen congelado lo encontramos en el apoyo que esta tecnología puede proporcionar a técnicas de reproducción asistidas como el sexado de semen de cerdo por citometría de flujo, pues para su realización el semen debe ser congelado al menos dos veces. El sexado de semen de cerdo aunque aún debe superar varias pruebas para que sea rentable facilitará la implementación de nuevos esquemas de cruzamiento con gran impacto en las estrategias de mercado y en la eficiencia reproductiva.
El semen congelado también puede apoyar en el control y prevención de la transmisión de enfermedades, ya que permite el monitoreo adecuado del semen antes de su ingreso al hato reproductor, descartando oportunamente la presencia de patógenos transmisibles, como por ejemplo los circovirus porcinos tipo 2 (PCV2) o el virus del síndrome reproductivo respiratorio porcino (PRRS), ya que la ausencia de signos clínicos, la viremia y el estatus serológico de estas enfermedades en sementales, no son indicadores adecuados para descartar la presencia de estos virus en el semen. La detección de patógenos seminales demanda de pruebas diagnósticas que requieren de cierto tiempo, por lo que es aconsejable que los eyaculados permanezcan almacenados en espera de los resultados antes de su aplicación. Esto brinda por lo tanto la oportunidad de asegurar una bioseguridad global, de hecho para el mercado internacional existen condicionantes que obligan al exportador de semen a mantener almacenadas en nitrógeno líquido y en recipientes esterilizados muestras de los eyaculados comercializados por un mínimo de 28 días.
Por otra parte, la creación de bancos de semen congelado con normas altas de bioseguridad podría mantener una reserva genética que minimizará los efectos del brote repentino de alguna enfermedad infectocontagiosa o de algún desastre natural. Estos mismos bancos pueden funcionar como almacenes de adaptabilidad genética que permitan hacer frente al riesgo latente de demandas alimenticias inesperadas surgidas de cambios medioambientales, avances en el conocimiento de los requerimientos nutricionales humanos, fluctuaciones del mercado o presiones derivadas de la demanda social. De hecho la conservación de la variación génica (variantes alélicas), es particularmente importante para mantener tanto la biodiversidad de las poblaciones de cerdos autóctonas altamente adaptadas a su territorio de procedencia, como para tener un centro de acopio de donde seleccionar las características que los productores soliciten para producir animales más uniformes con base a las demandas mercantiles.
La liofilización es la técnica de preservación menos desarrollada pues aunque teóricamente es factible (se ha logrado con éxito en roedores), la termo sensibilidad del espermatozoide porcino ha brindado pobres resul- tados. Esta técnica se basa en una congelación rápida y una deshidratación que mantenga a la pastilla de semen liofilizado viable hasta su reconstitución y aplicación. Actualmente se han probado diferentes crioprotectores, derivados proteicos, amidas y azúcares en diversas concentraciones para obtener liofilizados de calidad, pero aunque algunos espermatozoides logran sobrevivir al proceso las motilidades y viabilidades obtenidas siguen siendo poco significativas.
El encapsulamiento es la técnica más prometedora, en ella se pretende reducir el número de espermatozoides utilizados para cada servicio pues reduce la pérdida espermática inducida por las contracciones del miometrio (pérdida retrograda). Por otra parte aumenta la viabilidad al reducir la susceptibilidad espermática a la fagocitosis de los leucocitos del tracto uterino y permitiendo una liberación gradual de los espermatozoides, pues la cápsula que los contiene funciona a la vez como barrera de protección y de reservorio espermático. La idea del encapsulamiento es simple: los espermatozoides se encapsulan en membranas semipermeables que les permiten mantener un intercambio de nutrientes y metabolitos con el medio uterino, pero manteniendo las tres ventajas descritas.
Estas cápsulas se producen con alginatos (principalmente alginato de Bario) que son biopolímeros que tienden a formar redes tridimensionales de hidrogel que favorecen la funcionalidad espermática. Esta técnica promete prolongar el tiempo de almacenaje manteniendo la fertilidad del semen tanto en anaquel, como una vez en el tracto reproductivo de la cerda.
De las pruebas funcionales
Las pruebas rutinarias incluidas en el espermograma pueden brindarnos excelente información sobre la subfer- tilidad asociada a alteraciones seminales, sin embargo estos métodos son de poco valor predictivo. Es por eso que la valoración espermática no puede basarse solamente en parámetros clásicos como motilidad, concentración total y morfología.
Ciertamente equipos y programas sofisticados tipo CASA no son costeables para los pequeños centros de IA, pero por otra parte existen pruebas denominadas funcionales que son sencillas y que pueden brindarnos gran información. Estas no son realizadas de manera rutinaria e incluyen la valoración de la integridad membranal (prueba de resistencia osmótica o HOST corto), evaluación acrosomal (Azul de coomassie), funcionalidad mitocondrial (prueba de la diaminobenzidina), pruebas de penetración homóloga (con ovocitos inmaduros obtenidos de rastro), etc. Todas ellas son consideradas pruebas complejas aunque en realidad son sencillas y en su mayoría no se llevan más de 15 minutos. La difusión de estas técnicas en diversos foros es crucial para enriquecer el análisis seminal.
La prueba funcional más utilizada actualmente es la prueba Dual HOST-Azul de Coomassie (HOST/BBC). En ella se coloca una muestra del eyaculado en un medio de cultivo hipotónico (75 mosm aprox.) a baño maría por 30 minutos. Posteriormente una alícuota de espermatozoides se monta en una laminilla, se fija con aldehídos y se sumerge en una solución con el colorante azul de Coomassie por 3 min. En la valoración los espermatozoides con membrana funcional, buscan controlar su osmolaridad y al estar en un medio hiposmótico reaccionan enrollando el flagelo, por lo que espermatozoides con flagelo enrollado, son considerados viables y funcionales. La tinción de azul de Coomassie es un colorante con gran afinidad por las proteínas, por lo cual las proteínas acrosomales toman una coloración muy intensa favoreciendo la valoración de la integridad. Otra tintinó muy sencilla es la tinción con diaminobenzidina (DBA) que nos permite diferenciar la funcionalidad mitocondrial (Figura 3)
Conclusiones
En la actualidad, el reto para el MVZ dedicado a la Andrología porcina es romper la barrera de la subjetividad a la que nos enfrentamos en la valoración seminal en granja o en centros de transferencia genética. Los diluyentes de extra larga duración y otras técnicas de conservación seminal emergentes han rebasado al espermograma tradicional. La información requerida debe valorar los parámetros que resulten ser verdaderos indicadores de fecundidad, para ello es necesario que los MVZ interesados en la andrología porcina y la conservación de semen se mantengan actualizados, aplicando pruebas controladas para mejorar sus criterios de valoración seminal, puesto que gracias a la difusión de los medios electrónicos (principalmente el internet), los productores poseen más información y por lo tanto exigen que las dosis de semen almacenado no sólo sean de alta sino también que quien las elabora y comercializa, respalden su potencial fertilizante.
Bibliografía recomendada
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Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno
