J.A. Herrera-barragán
C. Cruz-valencia
A.L. Guerrero-barrera
J.L. Quintanar-stephano
INTRODUCCIÓN
Las aves presentan características reproductivas morfo fisiológicas particulares y distintas a los mamíferos, entre éstas, en el tracto reproductor de los gallos, la ausencia de glándulas accesorias que aporten fluidos al eyaculado (Álvarez et al., 2020). Se ha reportado que el semen de gallo “no requiere una capacitación espermática” para lograr su capacidad fertilizante (Lemoine et al., 2011), sin embargo, otro estudio reporta un periodo de capacitación espermática, necesario de 40 minutos que puede ser inducido in vitro con un medio enriquecido con Ca2+ (Lemoine, 2009); en trabajos recientes se ha demostrado un efecto descapacitante in vitro de las proteínas oviductales, sin embargo no se describen parámetros característicos en el metabolismo espermático (Camarillo et al., 2019).
Por otra parte, es en el oviducto de la gallina donde se han identificado túbulos de almacenamiento que contribuyen a la descapacitación espermática para su almacenamiento, mediante el metabolismo de ácidos grasos u otros lípidos por el espermatozoide (Long and Conn, 2012; Sasanami, 2013), que pueden ser obtenidos en la dieta de las aves (Ashfar et al., 2020) y que contribuyen a mantener la viabilidad del espermatozoide, para garantizar la fertilización de los ovocitos, hasta por siete días después de la cópula (Bakst, 2010).
La implementación de la inseminación artificial en granjas de parvadas reproductoras puede contribuir a reducir costos de producción reduciendo el número de machos, además de poder transportar el semen a diferentes casetas o locaciones con un mayor grado de bioseguridad, así también la conservación de germoplasma de líneas germinales primarias abuelos y bisabuelos (Nakamura, 2017). Sin embargo, la inseminación artificial se ha realizado utilizando únicamente dos medios de conservación seminal conocidos como Beltsville Poultry Semen Extender (Sexton, 1977) y Lake (Lake, 1960) principalmente desarrollados para pavos, y los cuales fueros desarrollados hace más de 40 años. Es por lo anterior que el objetivo de este estudio fue determinar parámetros in vitro, del efecto descapacitante de las proteínas oviductales, en los espermatozoides de gallo, lo cual permitirá contribuir al desarrollo de nuevos medios de conservación seminal que incrementen la viabilidad de los espermatozoides durante su manejo y almacenamiento.
MATERIAL Y MÉTODOS
USO DE ANIMALES: Se cumplió con la NORMA Oficial Mexicana NOM- 062-ZOO-1999 – “Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio”. Se utilizaron 5 gallos de raza Lohmann Brown lite. También para la obtención de fluidos del oviducto se utilizaron 10 gallinas en el segundo tercio de postura, alojadas de manera individual en condiciones similares (Quintana, 2011).
OBTENCIÓN DEL SEMEN: Los eyaculados se obtuvieron mediante masaje dorso ventral, tres veces por semana de cada gallo (González-Santos et al., 2019), los cuales se mezclaron para integrar un pool semen, de éstos hasta obtener 25 en total. Cada pool semen se mezcló con medio Lake (Lake, 1960).
OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN PROTEÍNICA: Se obtuvo 1.5 mL de secreción oviductal (SO), para realizar un pool, del extracto de las 10 gallinas se mantuvo a 2°C para su manipulación (Ito et al., 2011). La fracción proteínica de la SO, se precipitó con 4 volúmenes de acetona a 2°C, por 30 min, enseguida se centrifugó a 14000 x g, 10 minutos, para recuperar el sedimento mediante evaporación del sobrenadante nitrógeno líquido (Thongboonkerd et al., 2002) la cuantificación se realizó por espectrofotometría a 595 nm (Noble et al., 2007). La descripción de la fracción proteínica, fue mediante electroforesis unidimensional; siguiendo la técnica descrita por Sajjadi et al., (2019).
INDUCCIÓN DE ESTADOS METABÓLICOS EN ESPERMATOZOIDES: Se utilizaron alícuotas con 200X106 espermatozoides en 1 ml de medio Lake. Espermatozoides en fresco, fueron evaluados antes de 10 minutos post eyaculación. Espermatozoides capacitados, se indujo, mediante la incubación del semen 1:1 en medio Lake durante 40 minutos a 38ºC (Lemoine et al., 2009); Descapacitados, se incubó el semen por 40 min a 37.5°C disuelto 1:1 con medio Lake suplementado con 200 μg/mL de la fracción proteínica de la SO, en obscuridad (Camarillo et al., 2019); Reacción acrosomal, se determinó en espermatozoides que fueron co-incubados con 20 μg de membrana perivitelina como inductor de la reacción acrosomal (Camarillo et al., 2019).
EVALUACIÓN ESPERMÁTICA: El porcentaje de espermatozoides con movimiento, se estimó mediante microscopía a un aumento de 40X con temperatura de 37°C en una alícuota de 15 μl. El porcentaje de espermatozoides vivos se determiné en una alícuota de 10-μL-teñida con eosina-nigrosina, para evaluar al menos 100 espermatozoides por preparación a 100 X, y determinar el porcentaje de espermatozoides vivos (Fischer et al., 2020). La concentración de Adenosín tri fosfato (ATP) en los espermatozoides, se utilizó el Kit Ensayo Bioluminiscente Adenosin 5´-trifosfato (ATP) SIGMA Life Science, que determina que la emisión luminosa directamente proporcional a la cantidad de ATP (McCapra, 1978), la cual se cuantificó con un espectrofluorómetro Perkin Elmer LS en la aplicación de concentración. De una alícuota seminal con 200X106 espermatozoides, se lisarón para recuperar 50 μl de esa lisis y se colocan en una celdilla de espectroflurómetro con 50 μL de reactivo del kit Bioluminiscente Adenosin 5´-trifosfato (ATP) SIGMA Life Science. En el espectrofotómetro se determina la concentración de ATP de cada muestra, comparándola con la intensidad emitida por la solución estándar de 100 micromoles de ATP contenida en el kit.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), para determinar la existencia de diferencias entre las variables (P<0.05).
INDUCCIÓN DE ESTADOS METABÓLICOS EN ESPERMATOZOIDES: Se utilizaron alícuotas con 200X106 espermatozoides en 1 ml de medio Lake. Espermatozoides en fresco, fueron evaluados antes de 10 minutos post eyaculación. Espermatozoides capacitados, se indujo, mediante la incubación del semen 1:1 en medio Lake durante 40 minutos a 38ºC (Lemoine et al., 2009); Descapacitados, se incubó el semen por 40 min a 37.5°C disuelto 1:1 con medio Lake suplementado con 200 μg/mL de la fracción proteínica de la SO, en obscuridad (Camarillo et al., 2019); Reacción acrosomal, se determinó en espermatozoides que fueron co-incubados con 20 μg de membrana perivitelina como inductor de la reacción acrosomal (Camarillo et al., 2019).
EVALUACIÓN ESPERMÁTICA: El porcentaje de espermatozoides con movimiento, se estimó mediante microscopía a un aumento de 40X con temperatura de 37°C en una alícuota de 15 μl. El porcentaje de espermatozoides vivos se determiné en una alícuota de 10-μL-teñida con eosina-nigrosina, para evaluar al menos 100 espermatozoides por preparación a 100 X, y determinar el porcentaje de espermatozoides vivos (Fischer et al., 2020).
La concentración de Adenosín tri fosfato (ATP) en los espermatozoides, se utilizó el Kit Ensayo Bioluminiscente Adenosin 5´-trifosfato (ATP) SIGMA Life Science, que determina que la emisión luminosa directamente proporcional a la cantidad de ATP (McCapra, 1978), la cual se cuantificó con un espectrofluorómetro Perkin Elmer LS en la aplicación de concentración. De una alícuota seminal con 200X106 espermatozoides, se lisarón para recuperar 50 μl de esa lisis y se colocan en una celdilla de espectroflurómetro con 50 μL de reactivo del kit Bioluminiscente Adenosin 5´-trifosfato (ATP) SIGMA Life Science. En el espectrofotómetro se determina la concentración de ATP de cada muestra, comparándola con la intensidad emitida por la solución estándar de 100 micromoles de ATP
contenida en el kit.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), para determinar la existencia de diferencias entre las variables (P<0.05).
Se realizó una prueba Tukey para determinar las diferencias entre las medias, de los valores de las variables en los diferentes estados metabólicos; Se utilizó el paquete estadístico de libre acceso EpiInfo 7.3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Los parámetros de evaluación espermática básica, se muestran en las gráficas 1 y 2; en las cuales se evidenció que: Los porcentajes de movilidad espermática, fueron similares (P>0.05) en semen fresco 97.6% y en espermatozoides capacitado 91.5%; estos porcentajes fueron mayores (P<0.05) a los determinados en espermatozoides con reacción acrosomal 61% y espermatozoides descapacitación 40%, los cuales fueron similares entre sí (P>0.05).
En espermatozoides con reacción acrosomal y descapacitados, aunque la movilidad fue evidente y similar entre ellos, ésta fue menor a la de los otros estados metabólicos sin embargo los porcentajes de espermatozoides vivos demostraron una viabilidad espermática, en todas las condiciones evaluadas.
En la ausencia de un ciclo estral como el de los mamíferos para la sincronización de la copulación con la ovulación, las aves dependen de almacenamiento espermático en el oviducto (Bakst, 2010), lo que garantiza la presencia de espermatozoides con capacidad fertilizante cuando el ovocito esté presente en el infundíbulo para su fertilización. Debido a la presencia de los TAE, el espermatozoide una vez depositado en el aparato reproductor de la hembra, puede sobrevivir entre 2-15 semanas en aves domésticas, como gallinas y pavas (Sasanami, 2013). Los porcentajes de espermatozoides vivos fueron similares (P>0.05) entre el semen fresco 96.8% y espermatozoides capacitados 91.6%, los cuales fueron significativamente mayores (P<0.05) a los espermatozoides con reacción acrosomal 72.9% y aquellos descapacitados 64.4%.
La condición de reacción acrosomal y descapacitación mostraron porcentajes similares (P>0.05). Después del proceso de capacitación espermática, la movilidad disminuye debido a la limitada energía de los espermatozoides (Harper et al., 2008). Esto hace evidente la necesidad de desarrollar medios de conservación espermática que limiten o disminuyan el gasto metabólico energético de los espermatozoides. Los hallazgos relevantes de este estudio demostraron una disminución de la movilidad en espermatozoides que les fue inducido el estado metabólico de descapacitación.
Los niveles energéticos determinados por la concentración de ATP (Gráfica 3), fueron similares a espermatozoides capacitados y aquellos con reacción acrosomal, lo cual demostró el efecto descapacitante viable in vitro de la fracción proteínica de la SO. La concentración de ATP, en el semen freso, fue de 59.41 μmol ATP/ml, en espermatozoides capacitados de 69.9 μmol ATP/ml, espermatozoides con reacción acrosomal 66.49 μmol ATP/ml y en espermatozoides descapacitados de 51.79 μmol ATP/ml, siendo estadísticamente similares (P>0.05). La viabilidad espermática de los espermatozoides descapacitados in vitro en las condiciones de este estudio, quedó demostrada al determinar que los niveles energéticos requeridos por los espermatozoides en el proceso de fertilización son similares independientemente de la actividad o estado metabólico de los espermatozoides, capacitación, reacción acrosomal y/o descapacitación (Nguyen et al., 2015), además de mantenerse viables los porcentajes de espermatozoides vivos y con movilidad.
CONCLUSIÓN
Es posible inducir la descapacitación espermática, utilizando proteínas de la secreción oviductal para desarrollar nuevos medios para la conservación seminal de los gallos.
Referencias bibliográficas
• Álvarez-Rodríguez, M., Ntzouni, M., Wright, D., Khan, K.I., López-Béjar, M., Martínez. C.A., & Rodríguez-Martinez. H. (2020). Chicken seminal fluid lacks CD9- and CD44-bearing extracellular vesicles. Reproduction in Domestic Animals, 55(3):293-300. doi: 10.1111/rda.13617.
• Ashraf. S., Bhatti, S.A., Nawaz, H., & Khan, M.S. (2020). Assessment of dietary selenium sources in commercial male broiler breeders: effects on semen quality, antioxidant status and immune responses. Pakistan Veterinary Journal, 40(1):13-18. http://dx.doi.org/10.29261/ pakvetj/2019.081
• Bakst, M. (2010). Role of the oviduct in maintaining sustained fertility in hens. Journal of Animal, 89:1323-1329. DOI: 10.2527/jas.2010-3663.
• Camarillo, R., Jiménez, I., Guzmán, A., Rosales, A., Rodríguez, F., Pérez-Rivero, J., Herrera, J. (2019). Oviductal proteins effect in rooster spermatic cryopreservation. CryoLetters, 40:352-356.
• EPI. Info R7. 2020. paquete estadístico de libre acceso Epi. Info 7R. https://www.cdc.gov/epiinfo/esp/es_pc.html
• Fischer, D.H., Failing, S.K., Meinecke Tillmann, S., Wehrend, A. & Lierz, M. (2020). Viability assessment of spermatozoa in large falcons (Falco spp.) using various staining protocols. Reproduction of Domestic Animals, 55(10):1383- 1392. https://doi.org/10.1111/rda.13785.
• González-Santos, J.A., Ávalos-Rodríguez, A., Martínez- García, J.A., Rosales-Torres, A.M. & Herrera-Barragán, J.A. (2019). Sperm morphophysiology in different sections of the rooster reproductive tract. International Journal of Morphology, 37(3):861-866. http://dx.doi.org/10.4067/ S0717-95022019000300861.
• Harper, C., Cummerson, J., White, M., Publicover, S. & Johnson, P. (2008). Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. Journal of Cells Science, 21:2130-2135. doi:10.1242/jcs.030379
• Ito, T., Yoshizaki, N., Tokumoto, T., Ono, H., Yoshimura, T., Tsukada, A., Kansaku, N. & Sasanami, T. (2011). Progesterone is a sperm-releasing factor from the sperm-storage tubules in birds. Endocrinology, 152:3952–3962. https:// doi.org/10.1210/en.2011-0237
• Lake, P.E. (1960). Studies on the dilution and storage of fowl semen. Journal of Reproduction and Fertility, 1:30-35.
• Lemoine, M.D. (2009). Potential Involvement of Several Signaling Pathways in Initiation of the Chicken Acrosome Reaction. Biology of Reproduction, 81:657–665. doi: 10.1095/biolreprod.108.072660. Epub 2009 Jun 10.
• Lemoine, M.S., Mignon-Grasteau, I., Grasseau, M., Magistrini, E. & Bleisbois, E. (2011). Ability of chicken spermatozoa to undergo acrosome reaction after liquid storage or cryopreservation. Theriogenology, 75:122-130. DOI: 10.1016/j. theriogenology.2010.07.017
• Long, J. & Conn, T. (2012). Use of phosphosphatidylcholine to improve the function of turkey semen stored at 4°C for 24 hours. Poultry Science Journal, 91:1990-1996. https://doi.org/10.3382/ps.2011-02028
• Nakamura, Y. (2017). Avian Biotechnology. Advanced Experimental Medicine and Biology, 1001:187-214. doi: 10.1007/978-981-10-3975-1_12.
• Nguyen, T.M.D., Seigneurin, F., Froment, P., Combarnous, Y. & Blesbois, E. (2015). The 5’-AMP- Activated Protein Kinase (AMPK) Is Involved in the Augmentation of Antioxidant Defenses in Cryopreserved Chicken Sperm. PLoS ONE, 10(7). doi:10.1371/journal.pone.0134420. doi: 10.1371/ journal.pone.0134420. eCollection 2015.
• Noble, J.E., Knight, A.E., Reason, A.J., Di Matola, A. & Bailey, M.J. (2007). A comparison of protein quantitation assays for biopharmaceutical applications. Molecular Biotechnology, 37:99–111. doi: 10.1007/s12033-007-0038-9.
• Quintana, J.A. (2011). Avitecnia: Manejo de las aves más comúnes (4a. Ed). Trillas. 405pp. ISBN, 9786071708113.
• Sajjadi, S.H., Ahmadzadeh, H. & Goharshadi, E.K. (2019). Enhanced electrophoretic separation of proteins by tethered SiO2 nanoparticles in an SDS-polyacrylamide gel network. Analyst, 145(2):415-423.
• https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/an/ c9an01759c#!divAbstract
• Sasanami, T.M. (2013). Sperm storage in the female reproductive tract in birds. Journal of Reproduction and Development, 59:334. doi: 10.1262/jrd.2013-038
• Sexton, T.J. (1977). A new poultry semen extender.1. Effect of extension on fertility of chicken semen. Poultry Science, J 56:1443-1446.
• Thongboonkerd, V., Mcleish, K., Arthur, J. & Klein, J. (2002). Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation, K Int, 62:1461-1469. doi: 10.1111/j.1523-1755.2002.kid565.x.
Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno Agosto- Septiembre 2021
