Herramientas prácticas para la clínica avícola. Parte II

MVZ MC Juan Carlos Valladares de la Cruz
Asesoría Avícola Independiente
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4. EL USO Y LA INTERPRETACION ADECUADA DE LAS PRUEBAS DE LABORATORIO

Los métodos de análisis de laboratorio usados en la industria avícola en la actualidad pueden detectar lesiones microscópicas, cantidades mínimas de microorganismos (o sus antígenos o ácidos nucleicos), anticuerpos, toxinas o residuos químicos en las aves, insumos o en el medio ambiente.
Los análisis de laboratorio permiten evaluar de manera oportuna las medidas de bioseguridad, manejo, nutrición y sanidad empleadas. Por medio del laboratorio se puede determinar el estado de salud de una parvada, detectar problemas sanitarios subclínicos e inaparentes, evaluar la eficacia de los programas de inmunización, cuantificar el grado de microbismo ambiental y evaluar la calidad de los insumos y de los productos obtenidos. El uso del laboratorio permitirá crear un historial de pruebas y resultados cuya interpretación será más fácil y adecuada; la interpretación de un sólo grupo de resultados es difícil y puede conducir a conclusiones erróneas.

Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas técnicas, los mismos reactivos y personal constante para minimizar los errores atribuidos a los procedimientos utilizados. Las técnicas usadas deben estar estandarizadas y dar resultados que se puedan cuantificar, además deben ser prácticas, accesibles y no ser demasiado costosas; las ventajas que se deberán obtener con su uso obviamente deberán ser muy superiores a los costos que implica el establecimiento de un programa de evaluación laboratorio. En la elección de las pruebas de laboratorio y en la interpretación de los resultados se debe considerar la sensibilidad, la especificidad y la repetibilidad de cada técnica, la relevancia de los resultados y su accesibilidad y costo.

Los tipos de pruebas usadas rutinariamente en un laboratorio de diagnóstico avícola son:

a. Pruebas de Patología: Necropsias e histopatología.
b. Pruebas de Serología.
c. Pruebas de Parasitología.
d. Pruebas de Microbiología.
e. Pruebas de Biología Molecular.
f. Pruebas de Bromatología y Análisis Químicos
g. Pruebas de Toxicología.

a. Pruebas de Patología: Las pruebas de patología tienen como objetivo identificar y cuantificar las lesiones de los tejidos y órganos del cuerpo.
Como ya se mencionó, las necropsias se utilizan para la detección de lesiones macroscópicas mientras que la histopatología tiene como objetivo identificar y describir las lesiones microscópicas de los tejidos. El estudio histopatológico usualmente ayuda a orientar el diagnóstico, la interpretación puede ser descriptiva, identificando las lesiones microscópicas de los tejidos. El resultado puede ser concluyente en algunos casos, por ejemplo, en las enfermedades neoplásicas es esencial para determinar el tipo de tumor (Enfermedad de Marek, Leucosis Linfoide, Leucosis Mieloide y Reticuloendoteliosis); en algunas enfermedades virales la presencia de cuerpos de inclusión es patognomónica, como en los casos de Viruela Aviar, Laringotraqueítis Infecciosa, Hepatitis con Cuerpos de Inclusión y Síndrome de Baja de Postura; en otros casos se puede observar el agente en las lesiones, como en la coccidiosis o en la aspergilosis (Figura 14). Finalmente en algunas ocasiones la histopatología sirve para cuantificar el grado de daño que las aves están teniendo en algunas enfermedades como en las micotoxicosis y en la Infección de la bolsa de Fabricio, donde incluso se puede determinar sí las aves están o no protegidas contra los desafíos de campo; en este caso se han desarrollado varios sistemas para cuantificar el grado de lesión bursal como un sistema indicador de protección.

Cuerpos de inclusión hCI.	Lesión patognomónica. Enf. De Marek.	Detección del agente Aspergilosis.

b. Pruebas de Serología: las pruebas de serología sirven para detectar la inmunidad humoral contra diferentes antígenos; las pruebas usualmente detectan anticuerpos séricos (de ahí su nombre de Serología) pero eventualmente pueden ser utilizadas para detectar anticuerpos en yema o en cualquier líquido corporal. Una prueba positiva indica que el ave posee anticuerpos contra el antígeno evaluado, lo que puede tener significados diversos.

Las pruebas de serología pueden ser cuantitativas o cualitativas. En las pruebas cualitativas el resultado se expresa como positivo o negativo, suelen ser poco sensibles y el suero no se diluye para ser procesado. Las pruebas cuantitativas permiten detectar la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra, en este caso los sueros se diluyen y el resultado usualmente se expresa como el “título de la muestra”, el título es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra. Las pruebas más comunes en avicultura son la aglutinación en placa para Mycoplasma y Salmonella; la micro aglutinación para S. pullorum, inmunodifusión en gel de agar para Adenovirus, Encefalomielitis, Infección de la bolsa de Fabricio, Reovirus e Influenza Aviar; inhibición de la hemaglutinación para Enfermedad de Newcastle, Influenza Aviar, Síndrome de Baja de Postura, Mycoplasma, Bronquitis Infecciosa y Coriza Infecciosa; virus suero neutralización para Infección de la bolsa de Fabricio, Adenovirus Aviar, Enfermedad de Newcastle, Reovirus y otros agentes, y finalmente la técnica de ELISA (ensayo inmunoenzimático) que actualmente es de las más utilizadas debido a su alta sensibilidad, facilidad de realización, disponibilidad de reactivos estandarizados, rapidez de los resultados y a que fácilmente se adapta a un sistema computarizado para hacer la evaluación estadística de los resultados, existen estuches comerciales para un gran número de enfermedades aviares como Enfermedad de Newcastle, Infección de la bolsa de Fabricio, Bronquitis Infecciosa, Reovirus, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella multocida, Salmonella enteritidis, Encefalomielitis Aviar, Influenza Aviar, Pneumovirus Aviar, Leucosis Linfoide tipos A-B y J, Laringotraqueítis Infecciosa, Anemia Infecciosa Aviar, etc.

Sin embargo ninguna de las pruebas de serología por sí mismas indica grado de protección, todas indican el nivel de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular, este nivel de anticuerpos debe ser racionalmente interpretado para poder decir si indica protección, exposición de campo o infección activa. La evaluación rutinaria y periódica del título de anticuerpos deberá correlacionarse con los calendarios de vacunación, el comportamiento clínico y el desempeño productivo de la parvada para establecer los parámetros esperados de acuerdo a la edad y a la función zootécnica de las aves para establecer los niveles considerados “normales” e interpretar adecuadamente las variaciones de la “normalidad” como inmunidad insuficiente, exposición de campo no controlada o enfermedad clínica aparente. En el caso de las pruebas de serología, es frecuente que se requiera de un muestreo seriado de la parvada para detectar seroconversión o bien, un incremento en el título de anticuerpos de las aves, lo cual es muy sugestivo de una exposición de campo hacia el agente evaluado.

c. Pruebas de Parasitología: Las pruebas de parasitología identifican el tipo y el número de parásitos existentes en las aves, ya sea externos y/o internos. Las técnicas utilizadas en avicultura son flotación, McMaster y observación microscópica. Su aplicación depende de la función zootécnica de las aves a analizar. Para la detección y cuantificación de los endoparásitos más frecuentes de las aves domésticas la muestra de elección es de heces. El análisis más frecuente es para la detección de coccidias por la técnica de McMaster y debe incluir además la diferenciación de las especies de Eimeria involucradas, las que se identifican con criterios morfológicos convencionales (Figura 15).

Figura 15. Prueba de MacMaster para la detección de Eimeria en heces.

d. Pruebas de Microbiología: estas pruebas detectan bacterias, hongos o virus, ya sea por medio de su aislamiento, identificación y tipificación o bien por la demostración de sus antígenos; usualmente se realizan a partir de tejidos de aves pero también se pueden hacer estudios a partir de alimento, agua, ingredientes, cama, instalaciones, equipo, etc. Algunas muestras de tejidos pueden contener cantidades importantes de bacterias saprófitas, restos celulares, anticuerpos, enzimas, índices extremos de pH o algunas otras sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos patógenos.

El aislamiento de un microorganismo a partir de una muestra implica que éste está viable (“vivo”) en dicha muestra. Sin embargo, la interpretación de las pruebas de aislamiento microbiano deben ser interpretadas con cautela. El aislamiento de un microorganismo no implica necesariamente su papel como patógeno en un proceso de enfermedad, puede eventualmente tratarse de flora saprófita o un agente vacunal. El microorganismo aislado puede requerir de una tipificación posterior, como una tipificación antigénica, la demostración de factores de virulencia, etc. Así mismo, la falta aislamiento del microorganismo no implica necesariamente que éste no sea la causa de la enfermedad.

En la Figura 16 se presentan algunos ejemplos de los resultados de aislamiento de microorganismos.

Es posible detectar la presencia de microorganismos sin que se lleve a cabo su aislamiento, demostrando sus antígenos en tejidos, improntas, líquidos corporales o macerados de órganos. La presencia de antígenos puede realizarse con antisueros específicos marcados con sustancias que después pueden ser visualizadas en un microscopio, como en los casos de la inmunofluorescencia y la inmunoperoxidasa (Figura 17); estas técnicas son cualitativas y la especificidad de los antisueros utilizados permite identificar con certeza subtipos antigénicos o cepas variantes.

Virus de la Enf. de Newcastle, prueba de aglutinación de fluido alantoideo con eritrocitos.	eritrocitos Salmonella enteritidis en agar XLT-4.	Aspergillus fumigatus en agar dextrosa Sabouraud.< td>

e. Pruebas de Biología Molecular: Los métodos más modernos para la detección de patógenos aviares utilizan la tecnología de la biología molecular y se basan en la detección del material genético (ácido desoxirbonuleíco o DNA y/o ácido ribonucleíco o RNA) del agente. Para poder realizar la identificación se requiere tener una cantidad suficiente de material genético, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) permite amplificar la cantidad de DNA hasta niveles detectables, posteriormente la identificación específica del material genético se puede realizar por diferentes técnicas. Estas técnicas se basan en la detección de una porción altamente específica del genoma de los microorganismos. Las ventajas de estas técnicas incluyen su rapidez, su alta sensibilidad y la posibilidad de tipificación de los microorganismos. Las desventajas de estas técnicas incluyen su costo, su elevado nivel de tecnología, la complejidad en la conservación de las muestras, y el requerir del conocimiento previo del material genético de los microorganismos. Con estas técnicas no pueden determinar la viabilidad del microorganismo detectado. Existen pruebas para la detección y pruebas para la tipificación de los microorganismos. Las pruebas de detección incluyen PCR, RT-PCR, PCR en Tiempo Real y PCR Anidada. (Figura 18).

Figura 17. Detección de antígenos en las muestras por Inmunoperoxidasa (A) y por Inmunofluorescencia (B).

f. Pruebas de Bromatología y Análisis Químicos: estas pruebas generalmente se utilizan para constatar la calidad de los alimentos y de los ingredientes usados en su elaboración. Generalmente las empresas avícolas establecen sus propios parámetros de calidad. (Figura 19).

Figura 18.Prueba de detección por PCR y separación de los segmentos amplificados en gel de agarosa teñidos con bromuro de etidio, la identificación de los fragmentos se hace por peso molecular.

g. Pruebas de Toxicología: Los análisis toxicológicos se utilizan para garantizar la inocuidad de los ingredientes para la fabricación de alimentos, en los alimentos para las aves y en los productos avícolas destinados al consumo humano, particularmente carne de pollo y huevo. Existe una gran cantidad de análisis toxicológicos que pueden detectar concentraciones muy pequeñas de residuos tóxicos, del orden de picogramos o nanogramos, como las espectrometrías de masas, la espectrometría infrarroja y la espectrometría de absorción atómica, así como las cromatografías de gases y de líquidos de alta resolución. Con el uso de estas técnicas se obtiene mayor sensibilidad, mayor precisión y mayor repetitividad, para garantizar la inocuidad alimentaria y las exigencias del comercio internacional. Son especialmente importantes para la detección de micotoxinas, metales pesados, dioxinas, hormonales, beta agonistas y residuos de antibióticos, para que los productos agropecuarios puedan cumplir con las especificaciones descritas en el Codex Alimentarious para la comercialización internacional de los mismos (Figura 20).

5. LA TERAPEUTICA AVÍCOLA.

La terapéutica avícola es una herramienta muy utilizada en la clínica avícola. Un clínico avícola debe poseer los conocimientos para el tratamiento de las enfermedades aviares con el fin de aliviar los signos y/o inducir la curación. Los clínicos avícolas deben conocer y aplicar los principios de la farmacocinética, la farmacodinamia, la prescripción y la posología de los medicamentos utilizados en las aves.

La efectividad de un fármaco antibacteriano para controlar un problema en una parvada depende de varios factores.

• Diagnóstico correcto.
• Prescripción adecuada al Diagnóstico.
• Sensibilidad del agente al fármaco.
• Posología correcta.
• Producto farmacéutico adecuado (calidad, concentración, vehículo, etc.).
• Administración adecuada (vía de administración,dosis, frecuencia).
• Ingestión y absorción de la dosis por el ave.
• Interacciones medicamentosas (adición, sinergismo, antagonismo, interferencia de biodisponibilidad) y
• Capacidad de respuesta inmunológica de las aves tratadas.

Figura 19. Determinación de la concentración de proteína y del perfil de aminoácidos con el Sistema de Espectroscopía de Reflactancia del Infrarrojo Cercano (NIR).

La medicación en la industria avícola tiene consideraciones especiales.

La vía principal de administración de medicamentos en las aves es la vía oral. Los medicamentos utilizados en las aves generalmente se aplican en el alimento o en el agua de bebida. La presentación de los fármacos puede ser líquida (solubles en agua) o en polvo (de los cuales hay solubles e insolubles en agua). Las presentaciones de los fármacos en polvo no solubles en agua se conocen como ”Premezclas Medicamentosas”. Los fármacos administrados en el agua o en el alimento tienen que conservar sus características farmacológicas aun cuando el vehículo en el que se administren tenga características particulares (por ejemplo dureza del agua, pH, grado de contaminación) o éste reciba algún tratamiento (por ej. tratamiento de potabilización de agua, mezclado y peletizado del alimento, adición de otras sustancias con actividad farmacológica, etc.).

La administración oral de los fármacos en las aves dificulta enormemente la dosificación, ya que hay que conocer con exactitud los niveles de consumo de agua o alimento y estos varían enormemente de acuerdo a la edad de las aves y a las condiciones climatológicas de su medio ambiente. También hay que considerar algunas particularidades de la fisiología de las aves. El tracto digestivo de los pollos es muy corto, el tránsito del bolo alimenticio es muy rápido y la temperatura corporal de las aves es superior al de las otras especies domésticas; estos factores ocasionalmente impiden que se puedan extrapolar datos de dosificación y farmacocinética entre mamíferos y aves.

La vía de administración del fármaco en las aves (agua o alimento) y la frecuencia de administración (periódica/temporal o permanente) también determinan la concentración del fármaco que puede alcanzarse en el plasma y las variaciones de esta concentración a través del tiempo.

Eventualmente algunas medidas de manejo, como por ejemplo, la restricción alimenticia, pueden interferir en la dosificación adecuada de los medicamentos en las aves.

Figura 20. Detección de aflatoxinas con la técnica de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (hPLC).

Cuando un clínico avícola decide administrar un tratamiento con algún fármaco antibacteriano, debe considerar la posibilidad de encontrar un problema de resistencia bacteriana. Si bien algunas bacterias son naturalmente resistentes a algunos fármacos antibacterianos, el fenómeno de Resistencia también puede ser adquirido y transmitido entre las bacterias, aun de géneros diferentes, por ejemplo por la transferencia de material extracromosómico o por el contacto con dosis subterapéuticas del fármaco. La resistencia adquirida puede ser múltiple (a varios antibacterianos al mismo tiempo) y puede adquirirse aun cuando las bacterias no hayan tenido contacto con el antimicrobiano.

El clínico avícola puede utilizar algunas herramientas de laboratorio para conocer la susceptibilidad de las bacterias causantes del problema al fármaco antibacteriano que se desea utilizar. Ambas herramientas son pruebas in vitro que requieren que la bacteria involucrada sea aislada e identificada, por lo que la obtención de los resultados suele durar varios días. Las pruebas de medición de la sensibilidad a los antibacterianos son la prueba de antibiograma y la prueba de concentración mínima inhibitoria. En ambos casos los resultados de las pruebas SOLO SON APLICABLES a la bacteria aislada y evaluada, por lo que la representatividad del aislamiento es esencial para la interpretación adecuada del resultado de la prueba.

El resultado se interpreta como Sensible o Susceptible cuando indica que una infección causada por esta cepa de la bacteria puede ser inhibida por los niveles del antibiótico alcanzados en suero o tejidos al aplicar la dosis del agente antimicrobiano recomendados para ese tipo de infección y la especie infectada, a menos que existan contraindicaciones. El resultado se interpreta como Intermedio cuando el resultado no es concluyente, esta categoría provee una “zona buffer” que puede prever pequeños factores técnicos no controlados, que causan discrepancias en la interpretación. Por ejemplo, un organismo resistente puede ser categorizado como susceptible o un organismo susceptible puede ser categorizado como resistente (errores mayores) especialmente para drogas con un margen estrecho de farmacotoxicidad.

El resultado se clasifica como Resistente cuando el aislamiento evaluado no es inhibido por las concentraciones sistémicas usualmente alcanzadas por el antimicrobiano en un esquema de dosificación normal y/o que caen en el rango donde mecanismos de resistencia microbiana específica son probables (ej. Beta lactamasas) y la eficacia clínica no ha sido acreditada en estudios de tratamientos.

Figura 21. Evaluación in vitro de la sensibilidad de una bacteria a los antimicrobianos. Prueba de Antibiograma (izquierda). Prueba de Concentración Mínima Inhibitoria (derecha).

6. LA MEDICINA PREVENTIVA

La medicina preventiva que se practica en la clínica avícola es principalmente realizada mediante la vacunación. Existe un gran número de vacunas y calendarios de vacunación. El propósito principal de la vacunación es inducir una elevada producción de anticuerpos para proteger contra los desafíos de campo. Una segunda razón para la vacunación es la hiperinmunización de las gallinas para que transmitan un nivel elevado de protección hacia su progenie. La selección de las vacunas y de los calendarios de vacunación frecuentemente se convierte en un ejercicio de análisis de riesgos y costos

Tan importantes como los tipos de vacunas y los calendarios de vacunación son los métodos para la conservación y la aplicación de las vacunas en el campo.

Una de las funciones más importantes del clínico avícola es el diseño del calendario de vacunación y la selección de las vacunas respectivas, así como la selección de los métodos más adecuados para su aplicación; la “presión de infección” y la edad de vacunación son dos criterios importantes para el diseño de un calendario de vacunación. Los métodos de vacunación más utilizados en la industria avícola son la inoculación subcutánea, la aplicación ocular, la aplicación oral en agua de bebida y la aplicación por aspersión (Figura 22). Cada método tiene sus ventajas y sus desventajas.

Figura 22. Métodos de vacunación utilizados en aves: subcutáneo (izquierda), aspersión (centro), agua de bebida (derecha).

Las pruebas de laboratorio de serología son una herramienta importante para determinar la efectividad del calendario de vacunación.

7. LA EPIDEMIOLOGIA Y LOS ANALISIS DE RIESGO

La Epidemiología estudia a las enfermedades a nivel de población, su presentación en tiempo y espacio y los factores que determinan su presentación. La medicina de las aves comerciales se clasifica como medicina de poblaciones, por lo que para los clínicos avícolas los principios epidemiológicos son fundamentales para controlar y prevenir las enfermedades de las aves. Los índices epidemiológicos que se utilizan con mayor frecuencia en la clínica aviar son las tasas de Prevalencia (número de enfermos o infectados en una población, en un momento determinado), Incidencia (número de casos nuevos en una población durante un período determinado), Morbilidad o Tasa de Ataque (número de enfermos del total de animales expuestos), Mortalidad (número de muertos del total de animales expuestos) y Letalidad (número de muertos del total de animales enfermos). En la mayoría de las enfermedades de las aves los índices epidemiológicos están bastante bien caracterizados.

Las zonas geográficas de producción avícola tienen tasas de incidencia de enfermedades razonablemente caracterizadas y los clínicos avícolas pueden evaluar la posibilidad de riesgo de que dichas enfermedades se presenten en una explotación. Esta información se utiliza frecuentemente para diseñar los programas de vacunación. En México existen cifras oficiales de la incidencia de las enfermedades que están sujetas a regulación oficial como la Influenza Aviar (Figura 24), la Enfermedad de Newcastle (Figura 25) y Salmonelosis Aviar (Figura 26).

Figura 24. Situación oficial de la Influenza Aviar en México en el año 2011.	Figura 25. Situación oficial de la Enfermedad de Newcastle en México en el año 2011.	Figura 26. Situación oficial de la Salmonelosis en México en el año 2011.

Conclusión

En la práctica de un clínico avícola es necesario tener una visión objetiva, multidisciplinaria e integral de los problemas sanitarios y productivos que se presentan en las aves comerciales.

Los clínicos avícolas deben conocer las características de los sistemas de producción de las explotaciones avícolas, incluyendo las instalaciones, manejo, alimentación y eficiencia productiva.

Los programas de Sanidad Avícola requieren de un programa de investigación constante que determine las características de los desafíos de campo de los agentes infecciosos que afectan a las aves (tipos y subtipos de agentes, virulencia, intensidad del desafío, edad a la infección, etc.); debe existir un control exacto de los sistemas de vacunación utilizados, tanto del proceso de vacunación como de los productos utilizados; la efectividad de las vacunas debe ser evaluada en todos los niveles de utilización (progenitoras, reproductoras, pollo de engorda y gallina de postura); es recomendable el análisis constante de los ingredientes y de los alimentos terminados para garantizar su calidad nutricional y su inocuidad toxicológica; también necesario conocer las causas y la proporción de los decomisos en las plantas de procesamiento. Las características epidemiológicas de las regiones donde las aves son criadas son importantes para conocer los riesgos potenciales que pueden sufrir las aves durante su etapa de producción.
A manera de ejemplo, en el Cuadro 1 se presentan las herramientas para el diagnóstico diferencial de las enfermedades inmunodepresoras que afectan a las aves domésticas criadas en condiciones comerciales, donde se puede apreciar algunas de las herramientas prácticas que un clínico avícola utiliza durante su trabajo.

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