Raúl Rodríguez
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán – UNAM,

Luis Gómez-Núñez
Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.

Fernando Diosdado
Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.

Atalo Martínez
Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.

José Francisco Rivera-Benítez
Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.
Correo: [email protected]

INTRODUCCIÓN

Numerosas enfermedades que afectan a los cerdos pueden transmitirse por contacto entre la misma especie o con otras especies. La fauna externa presente en las granjas porcinas, además de ser un reservorio, puede ser una vía de transmisión de diferentes agentes infec- ciosos. Está plenamente documentado que existen enfermedades transmitidas por roedores a porcinos, tal es el caso de la leptospirosis o el virus de la encefalomiocarditis, entre otras.

Existen antecedentes de agentes virales, miembros de la familia Paramyxoviridae que tienen la capacidad de infectar a una gran gama de hospederos, principalmente cuando éstos comparten un nicho ecológico.

Históricamente, ha surgido la interrogante de qué papel juegan los roedores en la trans- misión de infecciones que aparentemente son exclusivas del cerdo. En nuestro contexto nacional, la enfermedad del ojo azul (EOA), ocasionada por el Rubulavirus porcino (RVP), se ha vuelto endémica de la zona central y centro-occidental. La principal interrogante que surgió después de su primera aparición en la década de 1980, fue, ¿cuáles son los posibles reservorios o vectores que potencialmente pueden servir para diseminar la enfermedad?

La primeras investigaciones realizadas en 1981, por Pasternack, evidenciaron la presencia de anticuerpos contra el RVP en ratas capturadas en granja, se registraron títulos de anticuerpos de 1:20, presentando una correlación de seroprevalencia del 11% con respecto a la seroprevalencia en cerdos (Pasternack, 1981). En la misma década, se experimentó la inoculación intracerebral en ratones adultos con RVP-VLPM84, ocurriendo la muerte entre los tres a cinco días post inoculación, logrando el reaislamiento viral de cerebro, pulmón, hígado y bazo, al inocular macerados de éstos en células PK-15, reportando también el tropismo del virus hacia sistema nervioso central y tracto respiratorio (Digiacomo, 1986, Meinert, 1986).

FIGURA 1. Hemoaglutación para titular las cepas del Rubulavirus porcino.

FIGURA 2. Inoculación intracraneal del Rubulavirus porcino en ratón CD-1.

FIGURA 3. Inoculación intracraneal del Rubulavirus porcino en ratón CD-1.

FIGURA 4. Muestreo sanguíneo para las pruebas de IHA y Elisa.

Schlesselman en 1982, inoculó el RVP a ratones de aproximadamente seis semanas de edad, los cuales manifestaron un cuadro clínico en el que se observó postración con respiración abdominal, exudado nasal seroso escaso, arqueamiento del dorso, pelo hirsuto, incoordinación a la marcha y parálisis de los miembros anteriores, presentándose la muerte a las 48 h post inoculación (Schlesselman, 1982).

También en felinos se experimentó la infección con el RVP, encontrando que el virus no genera daños patológicos o cuadro clínico asociado; se demostró que de forma experimental la replicación del virus en los felinos (Arellanes et al. 1994). También se ha experimentado en ratas de la cepa Wistar donde se evaluaron los títulos de anticuerpos, respuesta celular, viremia, encontrando que no genera efectos patológicos al ser inoculado vía intramuscular (Cuetero et al., 1995).

Se ha detectado la presencia de anticuerpos contra RVP en murciélagos, en la costa del Pacífico (Salas-Rojas et al. 2004) y en la zona central de México. En este último estudio, se tomaron muestras de suero sanguíneo para las pruebas de seroneutralización e inmunoperoxidasa en cultivo celular, y cortes de cerebro para detección molecular mediante RT-PCR gen HN y aislamiento viral, resultando las muestras de algunas especies de murciélagos positivas a las pruebas mencionadas, lo que sugiere pueden existir reservorios diferentes al cerdo (Cuevas- Romero et. al. 2014).

No ha quedado claro si los roedores son susceptibles del todo, tampoco si pueden generar una respuesta humoral detectable con las técnicas disponibles. Además de que los estudios realizados en la década de 1980 no contemplaban algunas variables, la infección experimental fue realizada con cepas aisladas en los primeros brotes de la enfermedad. Se desconoce si las cepas que circulan actualmente, debido a un proceso de adaptación, tienen la capacidad de infectar múltiples especies, en este caso una (roedores) con la que los cerdos conviven día con día.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar, en la infección experimental con Rubulavirus porcino (RVP), los signos, lesiones, carga viral y seroconversión de tres cepas virales en dos modelos de ratón de laboratorio.

GRÁFICA 1. Supervivencia de ratones BALB/c inoculados con RVP-LPMV 84.

GRAFICA 3. Supervivencia de ratones CD-1 inoculados con RVP-VLPM84.

GRÁFICA 5. Supervivencia de ratones CD-1 inoculados con RVP-147.

GRAFICA 2. Supervivencia de ratones BALB/c inoculados con RVP-93.

GRAFICA 4. Supervivencia de ratones CD-1 inoculados con RVP-VLPM84.

MATERIAL Y MÉTODOS

Cepas virales

Para el inóculo se utilizaron dos cepas del RVP aisladas en el año 2013 y la cepa de referencia aislada en 1984, las cepas fueron denominadas RVP-93, RVP-147 y RVP- LPMV-84, respectivamente. Cada uno de los virus fue replicado in vitro en células PK-15 en botellas y titulados mediante el método de Reed-Muench, en placas de 96 pozos como se muestra en la figura 1, cada cepa viral fue ajustada a 106 DICC50%/ml.

Animales de experimentación

Se utilizaron ratones de 21 días de edad con un peso promedio de 18 g, de las líneas BALB/c y CD-1, se dejaron en adaptación por cinco días post destete antes de la inoculación en grupos de cinco individuos.

CUADRO1. Órganos de ratón de los cuales se logró reaislamiento viral.

ÓRGANO PARA
REAISLAMIENTO

GRUPO INOCULADO

DÍA EN QUE FUE RECOLECTADO
EL TEJIDO POST INOCULACIÓN
.

Cerebelo

10-3

10 días P.I.

Encéfalo, hemisferio derecho

10-2

4 días P.I.

Cerebelo

10-1

8 días P.I.

Células

Para el reaislamiento viral se usaron células PK-15 sembradas en placas de 96 pozos con fondo plano y en botellas de 25 cm2 en una confluencia del 80%.

Métodos

Los ratones se inspeccionaron dos veces por día, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana (NOM- 062-ZOO-1999). La inoculación del virus fue intracraneal como se muestra en las figuras 2 y 3, con un volumen de 30μL (una cepa por grupo), a diferentes concentraciones virales partiendo de la titulación en las células PK-15, más un grupo control con ratones inoculados con solución salina estéril.

En la necropsia se seleccionaron órganos, una sección fue fijada con formol amortiguado al 10% y otra fue congelada a -70°C para su posterior procesamiento para la prueba de RT-PCR y reaislamiento viral; los órganos colectados fueron: tráquea, pulmones, corazón, hígado, bazo, páncreas, riñón, vejiga, cerebelo y cerebro. De los animales convalecientes se tomó muestra sanguínea para la detección de anticuerpos por medio de inhibición de la hemaglutinación y ELISA (figura 4.)

FIGURA 5. Equipo de RT-PCR en tiempo real.

FIGURA 6. Extraciones de RNA del Rubulavirus porcino de tejidos de ratón y placa conservada luego de realizar la prueba de RT-PCR en tiempo real.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inoculación experimental

Se lograron generar signos clínicos a partir de los 4 días post inoculación en algunos de los ratones inoculados vía intracraneal acorde a la dosis inoculada. En las gráficas 1-5 se detalla la sobrevivencia de cada grupo de ratones inoculados.

Resultando bajo el cálculo de Reed-Muench que:

  • La dosis letal para BALB/c inoculados con 30μL de PorVP-93 es 103.875
  • La dosis letal para CD-1 inoculados con 30μL de RVP-93 es 102.166
  • La dosis letal para CD-1 inoculados con 30μL de RVP-147 es 103.666
  • La dosis letal para CD-1 inoculados con 30μL de RVP-VLPM84 es 103.666

CUADRO 2. La diferencia en los valores de la media alrededor
de los grupos tratados son mayores que lo que se podría
esperar por cambio, hay diferencia significativa (P=0.023).

ANÁLISIS DE VARIANZA SOBRE RANGOS, MÉTODO DE
KRUSKAL-WALLIS DE UNA SOLA VÍA.

PRUEBA NORMAL

FALLADA
(P < 0.050

GRUPO

N DE
MUESTRAS

PÉRDIDAS

MEDIA

25%

75%

106

36

0

32.339

25.691

33.530

10-1

48

0

32.562

6.472

37.109

10-2

23

0

31.362

28.533

35.724

10-3

12

0

0

0

14.313

H=9576 con 3 grados de libertad. (P = 0.023).

Las demás dosis letales no fueron determinadas ya que el 100% de los anima- les presentó mortalidad en todas las diluciones del inóculo.

Reaislamiento viral

De las placas positivas a la HA, se colectó del sobrenadante 100μL y se diluyó 1:100 con 900μL de EMEM sin SFB, y después del tercer pase en placas de 96 pozos, se inoculó in vitro en botellas de 25 cm2 sembradas con células PK-15 cuya confluencia fue de entre 75% a 85%.

Las muestras de las que se logró el reaislamiento viral se muestran en el cuadro 1.

Resultados de la prueba de RT-PCR en tiempo real

La prueba se realizó en un termociclador BioRad® (figuras 5 y 6). De los órganos seleccionados para la prueba de RT-PCR en tiempo real, tráquea, pulmón, corazón, hígado, páncreas, bazo, riñón, vejiga, cerebro y cerebelo, únicamente se obtuvieron resultados positivos en bazo, pulmón, cerebro y cerebelo.

El modelo estadístico empleado fue en base al sistema computacional SigmaStat®3.5 cuyo método fue ANDEVA con la variante de Kuskal-Wallis y el método de Dunn (Cuadros 2 y 3), pues dichos métodos son pruebas no paramétricas y se usan para cuando existan 3 o más grupos experimentales afectados por uno o diferentes factores y cuyas muestras entre grupos difieren de cantidad de datos.

Estos métodos dieron resultados significativos al comparar los diferentes grupos dentro de la línea de ratón CD-1 inoculados con RVP-VLPM84.

CUADRO 3. Por medio del método de Dunn se analizó la diferencia
entre grupos de la línea de ratón CD-1 inoculados con RVP-VLPM84.

COMPARACIÓN

DIFERENCIA DE
RANGOS

Q

P<0.05

10-2 vs 10-3

33.136

2.697

Si

10-2 vs 106

4.233

0.460

No

10-2 vs 10-1

0.344

0.0393

No comparable

10-1 vs 10-3

32.792

2.945

Si

10-1 vs 106

3.889

0.511

No comparable

106 vs 10-3

28.903

2.514

No

Para aislar los grupos, o grupos que difieren de otros, se procede a usar una comparación múltiple. Se procedió a la comparación múltiple de todas las parejas por el método de Dunn.

Prueba de ELISA

La prueba se realizó en placas de 96 pozos (figuras 7 y 8). En la gráfica 6 se muestra la seroconversión de los sueros de los ratones CD-1 inoculados con RVP-93, cuyos sujetos resultaron convalecientes y en la figura 9 se muestra el equipo con que se realizó la lectura de las densidades ópticas.

La prueba de HA se realizó para ajustar las unidades hemoaglutinantes del virus de campo de 64UHA a 8UHA corroborando resultados para cada prueba de IHA (Figura 10) realizada con sueros de ratones convalecientes. Los sueros positivos y negativos son provenientes de estudios anteriores realizados en cerdos dentro del CENID-MA INIFAP, Departamento de virología.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La inoculación intracraneal en ratones de 26 días de edad, generó cua
ros clínicos nerviosos y respiratorios similares a los reportados en lechones menores a 30 días. La relación entre los días en que se manifiestan los primeros signos es inversamente proporcional a la concentración viral inoculada por la vía intracraneal, es decir, a mayor concentración viral, menor es el tiempo en presentarse los primeros signos clínicos.

Comparando ambas líneas de ratón, los BALB/c son más susceptibles a las cargas virales (altas o bajas), que los CD-1, ya que en el caso de los primeros días, aún en mayores diluciones generaban cuadros clínicos y en el caso de los ratones CD-1 se logró calcular la D.L.50% en diluciones no tan alejadas de la carga viral inicial calculada en el laboratorio por medio de las células PK-15.

GRÁFICA 6. Densidades ópticas registradas de los anticuerpos contra la HN del Rubulavirus porcino de los sueros de ratón.

GRÁFICA 7. Placa sensibilizada con la proteína recombinante HN para la prueba de Elisa.

GRÁFICA 8. Placa de Elisa indirecta lista para la lectura en el espectrofotómetro.

GRÁFICA 9. Espectrofotómetro para lecturas de la densidad óptica para la prueba de Elisa.

Comparando las tres cepas virales, con base a lo observado durante el proceso en que se manifestaron cuadros clínicos, la cepa RVP-93 presenta una menor virulencia que las cepas RVP-LPMV y RVP-147, estas dos cepas fueron aisladas en La Piedad, Michoacán, estado donde la enfermedad es considerada endémica. La cepa RVP-93, al ser evaluada en los ratones, ocasiona un proceso infeccioso, sin embargo, aunque logró ocasionar mortalidad en las diferentes concentraciones, algunos ratones toleraron la infección por lo que se pudo determinar en esta cepa la D.L.50% en ambas líneas de ratón. En las cepas RVP-147 y RVP-LPMV no fue posible calcular la DL50% en los ratones BALB/c debido a que aún con títulos virales de 1 x102 DICC50%, los ratones tuvieron una alta sensibilidad a la infección con Rubulavirus porcino.

En las líneas de ratones BALB/c y CD-1, los animales que sobrevivieron a la infección por Rubulavirus porcino, se procesaron muestras de suero para detectar la presencia de anticuerpos por la prueba de inhibición de la hemaglutinación. Los animales inoculados por la vía intracraneal con concentraciones bajas que no manifestaron cuadros clínicos, tuvieron una seroconversión capaz de ser detectada por la prueba de inhibición de la hemoaglutinación y se observa una relación positiva con la carga viral y los títulos de anticuerpos generados, a mayor carga viral, mayor título de anticuerpos, sin embargo varía dependiendo de la susceptibilidad del individuo, ya que algunos ratones tuvieron una respuesta inmune con títulos altos a pesar de pertenecer a un grupo con una dilución baja del virus inoculado, estas pruebas generaron resultados con la misma sensibilidad y especificidad de estudios anteriores y que coincide a los resultados reportados en estudios como el realizado por Cuetero S.R., en el que la inoculación fue la vía intramuscular del Rubulavirus porcino en ratas de la cepa Wistar.

CUADRO 9. Respuesta serológica en ratones BALB/c inoculados con RVP-93 (4 semanas post inoculación).

CUADRO 10. Respuesta serológica en ratones CD-1 Inoculados con RVP-93 (4 semanas post inoculación).

CUADRO 11. Respuesta serológica en ratones CD-1 inoculados con RVP-VLPM84 (4 semanas post inoculación).

CUADRO 12. Respuesta serológica en ratones CD-1 inoculados con RVP-147 (4 semanas post inoculación).

IHA

GRUPO
10-3

GRUPO
10-4

Ratón 1

1:10

Ratón 2

1:10

Ratón 3

1:10

Ratón 4

1:10

Ratón 5

1:40

IHA

GRUPO 10-1

GRUPO 10-2

GRUPO 10-3

GRUPO 10-4

Ratón 1

1:320

1:40

1:40

1:40

Ratón 2

1:20

1:40

1:40

1:40

Ratón 3

1:20

1:20

1:40

1:40

Ratón 4

1:40

1:20

1:40

1:40

Ratón 5

1:20

1:40

1:40

IHA

GRUPO
10-3

GRUPO
10-4

Ratón 1

1:20

Ratón 2

1:20

Ratón 3

1:40

Ratón 4

1:40

Ratón 5

1:40

1:40

IHA

GRUPO 10-3

GRUPO 10-4

Ratón 1

1:20

Ratón 2

1:20

Ratón 3

1:40

Ratón 4

1:20

1:40

Ratón 5

1:20

1:40

En la prueba de RT-PCR en tiempo real se demostró que es posible detectar órganos que hayan sido sitios de replicación viral en los ratones y a la vez se puede calcular la carga viral mediante esta prueba, lo cual sirve para estudios posteriores sobre Rubulavirus porcino en el modelo heterólogo que es el ratón tanto de laboratorio como el de campo, cuya posibilidad de ser un reservorio u hospedero accidental no es descartable de acuerdo a lo reportado por Pasternack, Digiacomo, Meinert y Schlesselman que trabajaron con ratones estudiando al virus de ojo azul.

Los resultados obtenidos en este estudio, permiten establecer al modelo ratón, como una alternativa para la evaluación de cepas de Rubulavirus porcino (RVP), debido a que se logró determinar la susceptibilidad de dos líneas CD-1 y BALB/c, en las cuales se encontraron hallazgos importantes para la replicación de cuadros clínicos, carga viral y seroconversión, similares a las descritas en los cerdos, esto pudiera estar explicado por la presencia del receptor celular NeuAcα2-3Gal en ambas especies y que juega un papel preponderante en el reconocimiento e infección y del Rubulavirus porcino. Es posible evaluar la virulencia del Ruvulavirus porcino, debido a que el virus es capaz de replicarse en los ratones bajo condiciones experimentales a la inoculación intracraneal, y la línea de ratón CD-1 se puede usar para profundizar en las investigaciones del virus de ojo azul ya que se puede cuantificar la carga viral mediante la prueba de RT-PCR.

BIBLIOGRAFÍA

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Artículo publicado Los Porcicultores y su Entorno Noviembre-Diciembre 2016