PMVZ Naomi E. Santiago
MC. Rosalba Carreon Napoles
Depto. de Medicina y Zootecnia de Cerdos.
FMVZ-UNAM
Correo: [email protected]
La Diarrea Epidémica Porcina (DEP) es una enfermedad infecto contagiosa estrechamente relacionada a la Gastroenteritis Transmisible (GET) debido a que los virus que las ocasionan, pertenecen a la misma familia Coronaviridae, son agentes morfológica- mente idénticos pero antigénicamente diferentes.
Son virus de genoma ARN que no hemaglutinan y son sensibles a éter y cloroformo, pierden la infectividad a 60 ̊C. son susceptibles a la formalina (1%), anhidrocarbonato de sodio (4%), disolventes de lípidos, ácido fosfórico en yodóforos (1%), hidróxido de sodio (2%). Tienen un periodo de incubación entre 22-36 horas de manera individual y de 2 a 4 días a nivel de piara. Tiene una morbilidad del 100% y una mortalidad del 50% al 100%. La transmisión es de forma directa la ruta es fecal-oral, e indirecta por fómites como ropa, vehículos, etc.
Clinicamente producen signos y lesiones muy similares como lo son diarrea acuosa en lechones, vómito, deshidratación, acidosis metabólica, destrucción de los enterocitos y atrofia de las vellosidades del yeyuno e íleon en lechones menores de 2 semanas de edad con una alta morbilidad y mortalidad afectando los costos y disminuyendo la producción por lo cual el diagnóstico debe ser preciso en la diferenciación de estas enfermedades.
Estas enfermedades no representan un riesgo para la salud humana, pero su importancia radica en su rápida diseminación e impacto económico en el ganado porcino.
Para el diagnóstico de estas enfermedades es importante realizarlo a través de una historia clínica apoyada con signos clínicos, lesiones y pruebas de laboratorio.
A continuación se describen las técnicas de diagnóstico que se han utilizado para el diagnóstico de estas enfermedades.
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Lesiones causadas por virus de DEP, se observa atrofia de vellosidades en intestino. |
Lechón con Diarrea. |
Aislamiento Viral
Esta es una prueba altamente específica, pero requiere tiempo para obtener resultados. El virus de la DEP puede aislarse a partir de macerados de intestino delgado en la línea celular VERO (riñón de mono verde); sin embargo tiene la limitante de que es difícil adaptarlo pudiendo requerir de varios pasajes para poder visualizar efecto citopático que consiste en vacuolización de las células y formación de sincitios, y su replicación puede depender de enzimas para poder facilitarlo; además de que deben de realizarse varios pasajes de la muestra, lo que implica que el resultado se obtenga tardíamente.
En el caso del virus de GET, éste crece relativamente fácil en varias líneas celulares como las ST (testículo de cerdo) y PK (riñón de cerdo); donde podemos visualizar un efecto citopático de células redondeadas en un período de 3 a 5 días postinoculación, en algunas ocasiones también se puede requerir el realizar 2 ó 3 pases.
Esta prueba es preferible realizarla a partir de tejidos ya que las heces pueden provocar un efecto tóxico en el monoestrato celular y dar resultados falsos negativos.
Prueba de PCR para la detección del gen“S” para ambos virus. El fragmento de 859 pb corresponde a virus de GET y el de 651 pb a virus de DEP.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
El diagnostico por técnicas moleculares es altamente sensible y específico; la técnica más desarrollada es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) donde se detecta el genoma viral amplificando un fragmento de la secuencia de ADN. Para los virus ARN como es el caso de GET y DEP se realiza una RT-PCR donde hay una reacción previa con una enzima llamada “Transcriptasa Reversa” para convertir en cADN y seguir con el proceso de PCR.
Se recomienda el uso de la RT-PCR en muestras como los fluidos orales, tejidos y en heces. La RT-PCR detecta la infección temprana y la excreción del virus durante el lapso de tiempo entre la infección y la seroconversión.
Debido a que en estos virus se encuentran las siguientes 3 proteínas: la Glicoproteína S “Spike” o “E2”, la Fosfoproteína N “nucleocápside” y la Proteína de membrana “M” o “E1”; las pruebas moleculares van dirigidas a ellas y se seleccionan estos sitios como de gran utilidad para el diagnóstico, la epidemiologia y patogénesis.
Existen reportes de esta técnica utilizando estos sitios, “M” para el virus de DEP y “N” para el virus de GET o “S” para ambos virus pero con diferente posición y peso molecular, mostrando éxito en las pruebas con muestras de intestino y en heces como se muestra en la siguiente imagen: Una variante de esta técnica es la RT-PCR multiplex, en ella más de una secuencia puede ser amplificada pudiendo ser una buena opción para diferenciar entre estas enfermedades, e incluso abaratar costos.
En la actualidad ya se han desarrollado kits comerciales para su detección y diferenciación con diferentes sets de iniciadores para realizar detecciones más sensibles, específicas y rápidas.
Histopatología
Esta es una técnica básica, pero muy importante ya que nos permite identificar las lesiones presentes en el intestino delgado que consiste en la atrofia de las vellosidades principalmente. Se requiere un mínimo de 48 horas para obtener los resultados: 24 horas para la fijación y 24 para el procesamiento. Las muestras para el examen histopatológico, en este caso, yeyuno e ileón, deben ser colectadas en formalina buferada al 10%. El intestino debe de seccionarse en pequeños segmentos para asegurarse que el formol penetre muy bien en la luz intestinal con el fin de minimizar la autólisis y esto permitirá una mejor interpretación diagnóstica.
Vellosidades intestinales con virus de diarrea epidémica porcina. Técnica de inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica
En esta técnica se usa intestino delgado de los cerdos con cuadro clínico agudo. Este es un método sensible, especifico y rápido para la detección de virus. Los tejidos infectados son fijados en formol, se obtienen cortes de los mismos y posteriormente se tiñen con un conjugado monoclonal dirigido hacia la proteína M. Es importante colectar muestras de los cerdos gravemente afectados en las primeras 24 horas del inicio de la diarrea para poder visualizar vellosidades con el virus presente.
La presencia de estos virus también pueden apoyarse con otras pruebas complementarias como la microscopia electrónica para detectar partículas virales en material fecal o en tejidos infectados. La identificación de los coronavirus en heces puede ser difícil debido a que las partículas virales no son fáciles de detectar si las “espigas” se han perdido o no son claramente visibles, por lo que un punto clave es la fijación inmediata de los tejidos al momento de la necropsia. Esta técnica no puede diferenciar un virus de otro.
Otra prueba es la ELISA de captura que es mucho más sensible que la microscopía electrónica y permite diferenciar DEP de GET. Esta prueba permite detectar el antígeno en hisopos rectales de animales inoculados experimentalmente hasta por 11 días postinoculación. La prueba para antígeno utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido hacia varios epítopos del virus de DEP en hatos endémicamente infectados y en casos de diarrea persistente o en hatos donde la cantidad de virus es demasiado pequeña para detectarse por otros métodos. El usar anticuerpos monoclonales, permite una detección más prolongada de persistencia en la granja, sobre todo en aquellos hatos donde la higiene no es la adecuada y hay una continua introducción de animales.
Existe también una prueba de inmunoensayo cromatrográfico que es muy rápido, ya que en 10 minutos podemos obtener un resultado; es cualitativa, altamente sensible y específica y se realiza a partir de muestras de heces. Esta prueba nos permite diferenciar entre ambos virus.
Microvellosidades intestinales con la presencia de partículas del virus de GET
Inmunofluorescencia Indirecta (IFA)
Esta prueba se realiza en placas cubiertas con monocapas previamente infectadas con el respectivo virus y se utiliza para la detección de anticuerpos. Se realizan diluciones del suero y mediante un conjugado fluorescente, se detectan las muestras positivas examinando cada uno de los pocillos bajo un microscopio de fluorescencia Los cerdos infectados experimentalmente con virus DEP desarrollan títulos de anticuerpos detectable por 3 a 4 semanas después de la infección; la muestra se considera positiva arriba de un dilución de 1:40. Para el virus de GET esta técnica prácticamente no se utiliza, ya que se emplean de manera rutinaria pruebas de ELISA.
Ensayos Inmunoenzimáticos
Este tipo de pruebas también se utilizan para la detección de anticuerpos. Son pruebas muy sensibles, específicas, cualitativas y rápidas. Para el virus de DEP, los anticuerpos detectados por una ELISA de bloqueo dirigida a la proteína S alrededor del día 7; pero los máximos títulos se pueden detectar entre el día 7 y 9 postinfeccion. La prueba de ELISA detecta más tempranamente los anticuerpos en comparación con la IFA donde pueden detectarse hasta los 10 dias postinfección.
Para el virus de GET existen diferentes pruebas comerciales que utilizan anticuerpos monoclonales. Es una prueba de ELISA de bloqueo que puede diferenciar entre GET y el coro- navirus respiratorio gracias a la proteína S. La muestra puede salir positiva a una o a ambas enfermedades. Esta prueba; se puede utilizar de 2 a 3 semanas después de un brote de diarrea y los anticuerpos persisten por más de un año en el suero de animales infectados.pueden ser detectados por una ELISA de bloqueo dirigida a la proteína S alrededor del día 7; pero los máximos títulos se pueden detectar entre el día 7 y 9 postinfeccion. La prueba de ELISA detecta más tempranamente los anticuerpos en comparación con la IFA donde pueden detectarse hasta los 10 dias postinfección.
Para el virus de GET existen diferentes pruebas comerciales que utilizan anticuerpos monoclonales. Es una prueba de ELISA de bloqueo que puede diferenciar entre GET y el coronavirus respiratorio gracias a la proteína S. La muestra puede salir positiva a una o a ambas enfermedades. Esta prueba; se puede utilizar de 2 a 3 semanas después de un brote de diarrea y los anticuerpos persisten por más de un año en el suero de animales infectados.
Seroneutralización
Esta prueba consiste en detectar anticuerpos neutralizantes realizando diluciones dobles seriadas del suero problema y se confrontan con el virus problema usando monoestratos celulares como sistema indicador. Esta técnica se utiliza principalmente para el virus de GET, la línea celular de preferencia es la ST (testículo de cerdo). Se requiere que el suero sea colectado en las mejores condiciones de higiene ya que es una prueba que se realiza en condiciones de esterilidad. El tiempo para obtener el resultado es de 3 a 4 días y se detectan anticuerpos desde los 7-8 días postinfección y hasta por 18 meses. Es una prueba altamente específica y cuantitativa. Para el virus de DEP la limitante que hay es su escaso o nulo efecto citopático, que es necesario para poder interpretar esta prueba.
Las pruebas anteriormente descritas, representan herramientas que nos apoyaran a realizar un diagnóstico preciso y rápido, y se deberán seleccionar las más adecuadas de acuerdo a la situación de la granja.
Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno Noviembre-Diciembre 2013
