Diagnóstico Molecular del Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (vPRRS) mediante RFLP (restriction fragment length polymorphism): Ventajas y Desventajas
Nancy R. Martínez Bautista.
Unidad de Negocios Porcino, Zoetis-México
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Jaime JA, Case D, Pérez TH
Unidad de Negocios Porcino, Zoetis-México
El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es la enfermedad que más impacto ha tenido en la industria porcícola mundial, afecta a cerdos de diferentes edades, generando problemas reproductivos en el pie de cría y cuadros respiratorios en cerdos en la línea de producción, dando como resultado grandes pérdidas económicas en la porcicultura mundial (Neumann et al., 2005; FAO 2011). Esta enfermedad ha afectado a la industria porcina desde finales de los años 80’s y a pesar de existir avances significativos en su estudio, no ha sido posible su control y erradicación, debido principalmente, a las características de su agente causal.
En México, las autoridades sanitarias han reconocido la circulación del virus de PRRS en las granjas tecnificadas a partir del año 1999; sin embargo, a la fecha no se tienen datos oficiales de la prevalencia de esta enfermedad a nivel nacional.
El agente etiológico es el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (vPRRS), clasificado en la familia Arteriviridae, de acuerdo a sus características genéticas se han descrito dos cepas prototipo: las cepas tipo Europeas y las cepas tipo Americanas; este agente etiológico se caracteriza por su alta variabilidad genética y antigénica (Meulenberg, 2000).
Herramientas de laboratorio para el diagnóstico del vPRRS
Las herramientas diagnósticas desarrolladas para la identificicación y estudio de esta enfermedad, incluyen técnicas serologicas como ELISA (enzyme- linked inmunosorbent assay), inmunofluorescencia indirecta, inmunoperoxidasa, virus seroneutralización, y técnicas moleculares como RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), RFPL (restriction fragment length polymorphism) y secuenciación de la cadena de nucleótidos (Christopher-Hennings et al., 2002). Es importante mencionar que no todas estas técnicas están disponibles en México y que es necesario emplear más de una de ellas para realizar un diagnóstico confiable, además de llevar a cabo una correcta interpretación de los resultados y realizar un diagnóstico integral con la información obtenida en la granja; acciones que se verán reflejadas en una buena toma de decisiones.
Análisis de RFLP en el ORF5 del vPRRS
Los análisis RFLPs para el virus de PRRS se emplearon a partir de 1998 con el objetivo de diferenciar entre cepas vacunales y de campo, este método consiste en el uso de tres enzimas de restricción: MluI, HincII y SacII, para digerir o cortar el marco de lectura abierta 5 (ORF5) del genoma y clasificar la cepa viral según el patrón de corte obtenido, por ejemplo: el patrón de corte para la cepa americana de referencia VR2332 es 2-5-2 (Wesley et al., 1998). Este método permite obtener resultados de forma rápida, se pueden emplear diferentes tipos de muestras y no es costoso. En la utilización de esta herramienta se debe considerar que únicamente está diseñada para el análisis de sitios específicos dentro del ORF5 del virus de PRRS, el cual sólo representa el 4% del genoma de este virus y es el segundo gen con mayor variabilidad en su secuencia de nucleótidos, por lo tanto, la presencia de sustituciones, inserciones o deleciones de uno o más nucleótidos en el ORF5 pueden o no reflejarse en el patrón de corte obtenido en el RFLP.
Por tal motivo, el análisis de RFLP no es un método que nos permita en todos los casos diferenciar entre cepas homólogas y heterólogas, y no deber ser el criterio sobre el cual se tome una decisión de qué vacuna utilizar en las piaras o mediante el cual se evalúe el desempeño de los biológicos (Christopher-Hennings et al., 2002; Cha et al., 2004).
Se han empleado diferentes vacunas contra el vPRRS desde 1994, las más usadas y eficientes han sido las vacunas de virus modificado (modified live virus: MLV, por sus siglas en inglés) que brindan hasta un 100% de protección para virus homólogos, pero tienen la desventaja de proteger sólo entre un 50 a 80% contra la infección con cepas heterólogas, en las cuales la vacunación disminuye la duración de la persistencia y los signos clínicos, pero no la proporción de animales enfermos (Osorio, 2012; Flores-Mendoza et al., 2010; Cano et al., 2007a; Cano et al., 2007b), además de interferir de forma negativa en el diagnóstico de laboratorio de esta enfermedad (García, 2016). Las características propias de este agente viral no han permitido el desarrollo de una vacuna que confiera protección inmunológica ante la infección con virus heterólogos de PRRS.
Diferentes estudios han demostrado que al comparar cepas que tienen alta variabilidad genética en su secuencia de nucleótidos del ORF5, tienen un mismo patrón de corte en el análisis de RFLP (Christopher- Hennings et al., 2002; Murtaugh et al., 2010), y que una misma cepa puede tener variaciones en su patrón de corte durante la replicación del vPRRS in vivo. Cha y col en el 2004, demostraron la inestabilidad del RFLP, inocularon cerdos con la cepa VR2332 y posteriormente realizaron 13 pasajes del virus, recuperaron el virus en los cerdos infectados con la cepa VR2332 e inocularon nuevos cerdos con las clonas recuperadas de cada pasaje. Un total de 495 clonas de virus fueron recuperadas, de las cuales obtuvieron la secuencia de nucleótidos del ORF5 en las que identificaron 86 variantes nucleotidicas. Del total de las clonas recuperadas, 398 clonas mantuvieron el patrón de corte de la cepa VR2332 (2-5-2), y 97 clonas tuviros patrones diferentes (2-6-2, 1-5-2, 2-5-4 y 2-1-2).
Secuenciación del vPRRS
Debido a la complejidad que representa esta enfermedad para su estudio y gracias a los grandes avances tecnológicos en el area de salud veterinaria, actualmente se usan técnicas diagnósticas que proporcionan información más detallada sobre el vPRRS. La secuencia- ción completa o parcial del genoma viral permite identificar y caracterizar las variantes endémicas que están circulando en las granjas porcinas.
Figura tomada de Cha et al., 2004. Relación filogenética de las 86 variantes nucleotidicas y diferentes patrones de corte de RFLP obtenidos durante la replicación viral en los cerdos, basado en la secuencia de nucleótidos de ORF5.
La secuenciación del vPRRS, proporciona la secuencia de nucleótidos exacta, en la cual se puede identificar la presencia de sustituciones, inserciones o deleciones de uno o más nucleótidos, además permite hacer una comparación exacta de las cepas de vacunas comerciales con la cepas de campo y entre ellas mismas.
Todas las herramientas diagnósticas empleadas para el estudio del vPRRS, proveen información de utilidad, cada técnica tiene ventajas y desventajas en su uso, debido a lo cual es necesario tener claro cuál es la información que brinda cada uno de los métodos diagnósticos y seleccionar el más adecuado de acuerdo a las necesidades.
BIBLIOGRAFÍA
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Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno
