Mediante un sistema de digestión simulado controlado por computadora

Y. LI A,
G.M. ZHANG A, *,
H.Y CAIB,
F. YANB,
H.Y WANGA,
X PENGA
a Beijing Challenge Agricultral Technology
Co.,Ltd. Beijing, 100081, China.
b Tianjin Biofeed Technology Co.,Ltd. Tianjin, 301906, China.

RESUMEN

Se desarrolló un método de digestión de fósforo in vitro para evaluar el fósforo disponible de los alimentos, que fuera simple, rápido y reproducible. Las soluciones amortiguadoras (gástrica e intestinal) y el tratamiento adecuado de los residuos digestivos se desarrollaron para garantizar la detección precisa del contenido de fósforo en los residuos digestivos. Se verificó el paralelismo y la repetibilidad con un volumen de circulación de 1,23% a 5,38% en maíz, trigo, DDGS y harina de soya, lo que indica que el método in vitro fue preciso para estos ingredientes. Los grupos experimentales fueron creados con 72 cerdos divididos al azar en 4 grupos y se alimentaron respectivamente con 4 dietas que contenían 3.75, 4.77, 5.69 y 6.77 g de P/kg totales, y la digestibilidad aparente del fósforo fue de 23.26%, 37.09%, 47.34%, 54.82%, respectivamente. Los resultados entre la digestibilidad del fósforo in vitro e in vivo indicaron que tenían una estrecha relación lineal (R2 = 0.9864) y la precisión del método in vitro fue factible. En base a los resultados el método desarrollado puede usarse no solo para evaluar el fósforo disponible, sino también para evaluar el uso de fitasa en los alimentos.

INTRODUCCIÓN

Se sabe que el fósforo es un componente esencial del cuerpo animal y es el tercer ingrediente más caro de los alimentos. La digestibilidad y disponibilidad de fósforo en varios alimentos de origen vegetal varía del 10% al 60% (Weremko, 1997). Sin embargo, las determinaciones in vivo son costosas, laboriosas y requieren mucho tiempo, por estas razones desarrollamos el método in vitro. Las técnicas de digestión in vitro han predicho con éxito los valores energéticos de los alimentos para cerdos y aves de corral (Valdes y Leeson, 1992; Losada et al., 2009; Regmi et al., 2008; Zhao et al., 2014). Nosotros desarrollamos un nuevo método in vitro con un sistema de digestión simulado controlado por computadora (CCSDS) para evaluar el fósforo disponible de los alimentos. Este estudio también se realizó para verificar la viabilidad de este método innovador.

MATERIAL Y MÉTODO

El protocolo animal para esta investigación fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado Animal del Instituto de Investigación de Alimentos de la Academia China de Ciencias Agrícolas.

Procedimiento de digestión in vitro DESARROLLO DE SOLUCIÓN TAMPÓN Y FLUIDO DIGESTIVO SIMULADO.

La solución tampón gástrica se realizó usando 29.41 g/L de citrato trisódico dihidrato, 5.18 g/L de NaCl, 0.50 g/L de KCl, con un pH ajustado a 2.50 a 39°C añadiendo 300 mmol/L de HCl. La solución tampón del intestino delgado se preparó con 36.33 g/L de Tris y 5.20 g/L de NaOH. Se preparó fluido gástrico simulado con 2.6250 g/L de pepsina (Sigma P7000) para igualar la actividad in vivo de la pepsina en el fluido gástrico de cerdos. El líquido del intestino delgado simulado para la digestión intestinal in vitro estaba compuesto de 40.5 g/L de pancreatina (Sigma P1750).

PRINCIPALES PROCESOS DE DIGESTIÓN IN VITRO.

Diseñamos un CCSDS gastrointestinal continuo para cambiar automáticamente las condiciones de la digestión enzimática gástrica a intestino, el líquido del intestino delgado simulado se inyectó automáticamente después de la digestión gástrica en la cámara de digestión. Primero, se añadieron 0.5 g de ingredientes (0,0 g de ingredientes como grupo blanco) y 10 ml de fluido gástrico simulado a la cámara de digestión, luego se fijaron las cámaras de digestión y se colocaron en la incubadora con agitación. Con cuatro repeticiones por muestra y una cámara de digestión por repetición. El procedimiento de digestión in vitro fue realizado automáticamente por el software después de configurar los parámetros. A continuación, se añadieron 6 ml de solución tampón de intestino delgado y 1.6 ml de líquido intestinal semejando al líquido del intestino delgado en cada uno de los 5 tubos almacenados entre 4°C y 8°C.

Durante la digestión gástrica de 4 h, se mantuvo a 39°C mediante la incubadora con agitación a 180 rpm, para asegurarse de que las muestras y el líquido digestivo se mezclaran bien. Posteriormente, CCSDS bombeó solución tampón del intestino delgado y líquido del intestino delgado simulado automáticamente en las cámaras de digestión, respectivamente, para cambiar las condiciones de digestión gástrica a intestinal. La digestión intestinal duró 16 horas.

TRATAMIENTO DE RESIDUOS DIGESTIVOS.

Posterior a la simulación de la digestión, los residuos no digeridos se transfirieron a un matraz volumétrico de 100 ml con agua desionizada para ser mezclada y filtrada en una membrana de 0.22 μm. Después, se realizó la mezcla con 6:4 de filtrado y 0.4 M de ácido tricloroacético. Se dejó 10 min a temperatura ambiente para su reacción. La mezcla se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min para obtener su sobrenadante.

CURVA ESTÁNDAR Y DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE P EN RESIDUO DIGESTIVO.

Se aforó una solución estándar de fósforo 100 μg/ml y dihidrógenofosfato de potasio a 0.0, 0.5, 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y 12.0 ml en un matraz con capacidad de 100 ml para obtener 0.0, 0.5, 1.5, 3.0, 4.5, 6.0, 12.0 μg /mL de solución estándar de fósforo. Se añadieron 20 ml de molibdato de amonio y vanadio a cada matraz, se mezclaron y se añadió agua. La solución se colocó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se midió en un espectrofotómetro la absorbancia correspondiente a la serie de soluciones a 415 nm haciendo uso de una solución sin KH2PO4 como blanco. Se realizó una curva estándar tomando la absorbancia como abscisas y el contenido de fósforo (μg/mL) como ordenadas. Así mismo, se elaboró otra curva estándar en la cual se disolvió KH2PO4 en una solución digestiva simulada para investigar su influencia en la determinación del fósforo. Se mezclaron 6 ml de sobrenadante y 4 ml de solución de molibdato de amonio y vanadio, se dejaron reposar durante 20 min a temperatura ambiente para que se desarrollara todo el potencial colorimétrico. Para realizar la lectura a 415 nm en un espectrofotómetro.

Digestión in vivo

Para investigar la viabilidad del método, se estudió la digestibilidad aparente del fósforo en dietas de harina de maíz y soya con diferentes cantidades de hidrogenofosfato de calcio (dieta 1, dieta 2, dieta 3 y dieta 4). La composición química de los ingredientes se muestra en la tabla 1, los ingredientes y el valor nutritivo de las dietas experimentales se presentan en la tabla 2. Se utilizó un total de 72 cerdos para determinar la digestibilidad aparente del fósforo en las dietas de harina de maíz y soya en cerdos de cría (Duroc × Landrace × Yorkshire, con un peso corporal inicial de 37,0 ± 1,3 kg). Los cerdos se dividieron al azar en 4 grupos, cada grupo contenía 6 repeticiones de 3 cerdos por repetición.

Método para evaluar In Vivo el Fósforo disponible en alimentos Fosforo Disponible Alimentos 1

Los cerdos se alojaron en corrales y se instalaron bandejas de recolección de orina debajo de los corrales durante los períodos de recolección. Se formularon cuatro dietas basadas en harina de maíz y soya agregando 0, 6, 12 o 18 kg de fosfato dicálcico por tonelada (Cuadro 2). Los períodos experimentales duraron 8 días, con una adaptación a las dietas durante 6 días a las dietas experimentales. Se recolectaron orina y heces un mínimo de 2 veces al día. La orina fue recolectada en una botella, fue pesada y filtrada a través de algodón para eliminar las partículas sólidas. Las heces se recolectaron usando bolsas de plástico adheridas a la piel alrededor del ano (Van Kleef et al., 1994). Todas las muestras se congelaron a -20°C.

Posteriormente las heces fueron descongeladas, homogeneizadas y liofilizadas antes de los análisis. Las muestras fueron analizadas para determinar proteína cruda (GB/T 6432-2018), fibra cruda (Método 985.29) y grasa cruda (GB/T 14772-2008). El fósforo en el alimento y de las muestras fecales fue analizado por GB/T 6437-2018.

Método para evaluar In Vivo el Fósforo disponible en alimentos Fosforo Disponible Alimentos 2

Cálculos

El fósforo disponible in vitro (IVAP) del ingrediente secalculó de la siguiente manera:

IVAP (%) = ((a × OD415 + b) × 0,1 × 31) / (0,6 × m × DM × 1000) × 100 donde a y b fueron la pendiente y la intersección de la curva respectivamente, la DO415 es la diferencia entre la absorbancia de las muestras de alimento comparativamente con el blanco, m el peso de los ingredientes y MS el contenido de materia seca (%).

La digestibilidad in vitro del fósforo se calculó de la siguiente manera:

IVPD (%) = IVAP/P-total * 100 en donde P-total es el contenido total de fósforo en el pienso (%).

PD (%) = Retención/ingesta de P * 100 en el que la retención es la diferencia entre P ingesta diaria promedio (g) y P excreción diaria promedio (g), y P ingesta (g) es la ingesta promedio de 2 días.

Análisis estadístico

Se utilizó el procedimiento de regresión de SPSS para desarrollar modelos de regresión. Las diferencias en la digestibilidad del P entre las dietas se analizaron como un diseño completamente al azar utilizando SPSS (diferencias significativas = P < 0,05).

RESULTADOS

Curva estándar y efecto de la solución digestiva simulada en la determinación del contenido de P.

Las curvas estándar se desarrollaron para investigar la interferencia de la solución digestiva simulada en la determinación de fósforo (Figura 1). El color producido fue proporcional a la concentración de fósforo en la mezcla de reacción. El resultado mostró que las pendientes de las dos curvas estándar fueron 13.646 y 11.496, donde las intersecciones fueron -0.3072 y 0.0141, con unas R2 de 0.9993 y 1, respectivamente (Tabla 3).

Método para evaluar In Vivo el Fósforo disponible en alimentos Fosforo Disponible Alimentos 3

Repetibilidad del método in vitro.

A una diferencia pequeña entre las mediciones indica una mejor repetibilidad y el volumen de circulación (CV) es una medida estadística de precisión. La repetibilidad se evaluó comparando el fósforo digerible in vitro del mismo ingrediente en el alimento en los 3 ensayos repetidos (Tabla 4). En 3 ensayos, el fósforo disponible in vitro (IVAP) del maíz varió de 0.040% a 0.041% de MS (media = 0.040% de MS) y el CV varió de 4.70% a 5.38%. El IVAP medio del trigo y los DDGS fue de 0.077% y 0.778% de MS, con rangos de 0.076% a 0.078% y 0.777% a 0.779% de MS, respectivamente. El IVAP de la harina de soya osciló entre 0.154% y 0.129% de MS (media = 0.155%) y el CV varió de 1,38% a 2,13%. Para el mismo ingrediente, no se observaron diferencias significativas en el IVAP entre los 3 ensayos (P = 0.5124, 0.4813, 0.4306, 0.5652), lo que indica una buena repetibilidad de los valores del IVAP en diferentes ensayos.

Método para evaluar In Vivo el Fósforo disponible en alimentos Fosforo Disponible Alimentos 4

Digestibilidad aparente del fósforo en dietas experimentales.

En la tabla 5, se muestra la ingesta diaria promedio de alimento (ADFI), la ingesta P, la excreción y la retención P. Se midió el fósforo total en las 4 dietas. La dieta 1 contenía 3,75 g de P/kg total, la dieta 2, la dieta 3 y la dieta 4 contenían 4,77, 5,69 y 6,77 g de P/kg total, respectivamente. La ingesta diaria promedio de alimento aumentó ligeramente por el aumento de la concentración total de P en las dietas, aunque no de manera significativa. Como se muestra en la tabla 5, la suplementación con fosfato dicálcico mejoró la retención de P de forma lineal en la dieta 1, 2, 3 y 4; la digestibilidad aparente del fósforo aumentó linealmente de 23.26% a 54.82% (Tabla 6).

Método para evaluar In Vivo el Fósforo disponible en alimentos Fosforo Disponible Alimentos 5

Relación lineal entre resultados in vitro e in vivo.

El IVAP de la dieta 1, 2, 3 y 4 fueron 0.117%, 0.248%, 0.342% y 0.483%, respectivamente (Tabla 2). La digestibilidad del fósforo de las 4 muestras de piensos experimentales se obtuvo mediante un bioensayo in vivo y un método in vitro, calculado y mostrado en la Tabla 6. La digestibilidad del fósforo in vitro e in vivo de la dieta 1 fue 31.20% y 23.26%, con una diferencia de 7.94%; La digestibilidad in vitro e in vivo del fósforo de Dieta 2 fue 51,99% y 37,09%, la diferencia es 14,89%; El valor de Dieta 3 y Dieta 4 fue 60.11%, 47.34%, 71.34% y 54.82%, la diferencia es 12.76% y 16.52%. Aunque los resultados
in vitro son aproximadamente un 10% más altos que los in vivo, los valores de digestibilidad del fósforo in vitro e in vivo aumentaron con el aumento de P en la dieta, tienen una relación lineal muy estrecha (R2 = 0,9864), como se muestra en la Tabla 6 y figura 2.

DISCUSIÓN

Curva estándar y efecto de la solución digestiva simulada en la determinación del contenido de P.

Las pendientes y las intersecciones de las dos curvas estándar fueron similares y ambas mostraron una buena relación lineal. En comparación con la disolución en agua desionizada, los resultados mostraron que la solución digestiva simulada tuvo poco efecto sobre el desarrollo del color del molibdato de amonio. Por tanto, creemos que este método es factible para la detección de fósforo en residuos no digeridos

Repetibilidad del método in vitro.

La repetibilidad es importante para garantizar la fiabilidad de un nuevo método. Se seleccionó al azar un subconjunto de 4 ingredientes para las muestras de calibración, incluidos 2 granos (maíz y trigo), harina de soya y subproducto procesado de grano (DDGS) (Tabla 1). El volumen de circulación (CV) considerablemente más bajo indica que el uso del sistema de digestión simulado controlado por computadora (CCSDS) mejoró sustancialmente la repetibilidad de las determinaciones de la digestibilidad in vitro del fósforo (IVDP).

Digestibilidad aparente del fósforo en dietas experimentales.

Como afirmaron Fandrejewski y Weremko (1997), la digestibilidad el P en las dietas de maíz y soya fue del 24%, lo que fue consistente con el resultado de la Dieta 1 en este estudio. De manera similar, el resultado de Calvert y Besecker (1978) mostró que la digestibilidad aparente de P del fosfato dicálcico en las dietas de maíz era de 66.3% y 62.7% para los niveles de fósforo total de 0.3% y 0.5%, respectivamente. Sin embargo, la absorción y retención de fósforo fue significativamente mayor en la dieta que contenía 5.6 g de P/kg total que la dieta que contenía 4.0 g de P/kg total, reportado por Jongbloed en 1987, que es similar a los resultados de la Dieta 3 y la Dieta 2 (Tabla 5) en este estudio. Sin embargo, los resultados de digestibilidad del fósforo presentados de manera diferente no solo se relacionan con el hidrógeno fosfato de calcio sino también con los ingredientes del alimento.

Relación lineal entre resultados in vitro e in vivo.

Además de la rapidez, simplicidad, repetibilidad, la buena correlación entre los resultados in vitro y los resultados in vivo es importante para validar las técnicas de digestión in vitro (Boisen y Eggum, 1991). Wecke (1996) informó que la digestibilidad aparente del maíz y la harina de soya alimentados a los lechones era del 23%, que era similar a los resultados in vivo y mayor que los valores in vitro en la dieta. El estudio anterior de Schlegel (2014) sobre la regresión lineal de la digestibilidad total aparente de P en el tracto in vitro e in vivo mostró que la correlación era 0.91, la cual es menor que la de este estudio. Por lo tanto, el grado de relación entre los resultados in vitro e in vivo indica que la precisión del método in vitro es aceptable.

CONCLUSIONES

En conclusión, proporcionamos un nuevo método de digestión in vitro por medio del sistema de digestión simulado controlado por computadora que puede evaluar con éxito el fósforo disponible o la digestibilidad del fósforo de los alimento. La digestibilidad aparente obtenida por métodos in vitro fue aproximadamente un 10% mayor que los resultados obtenidos por bioensayo in vivo, sin embargo, tienen una relación lineal muy cercana (R2 = 0.9864). El método de este estudio es repetible y aplicable. El método in vitro puede proponerse como una herramienta económica para estimar rápidamente el fósforo disponible en los ingredientes de los alimentos para plantas. Puede usarse no solo para evaluar el fósforo disponible, sino también para evaluar el uso de fitasa en los alimentos. Sin embargo, son necesarias más comparaciones in vivo e in vitro para alimento diferentes de los estudiados aquí.

Agradecimientos

Este estudio se llevó acabo en el Departamento de R&D de Challenge Group (No, 12, Zhongguancun South Street, Beijing, China).

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Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno Marzo- Abril 2021