Susceptibilidad Antibiótica in vitro de Cepas Argentinas de Mycoplasma synoviae Aisladas de Gallinas de Postura Comercial

JAVIER URIARTE.
Cátedra de Microbiología – FCV- UNLP – Argentina.
ECO Animal Health PLC, UK.

NAIARA GAMARRA.
Cátedra de Producción Avícola – FCV – UNLP – Argentina.

AND RAÚL CERDA.
Cátedra de Microbiología – FCV- UNLP – Argentina.
ECO Animal Health PLC, UK.

RESUMEN

En el presente estudio se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) para 9 antibióticos (tilvalosina, tilosina, tilmicosina, tiamulina, enrofloxacina, doxiciclina, clortetraciclina y amoxicilina) frente a 10 cepas de Mycoplasma synoviae (MS) aisladas en granjas de gallinas de postura comercial de la República Argentina. Las CIMs se determinaron mediante el método de microdilución en placa utilizando las placas comerciales Sensititre®. De los antibióticos evaluados, la tilvalosina mostró la mayor actividad in vitro con una CIM90 de 0,06 μg/ml, seguida por tilosina (CIM90 = 0,25 μg/ml) y tiamulina (CIM90 = 0,5 μg/ ml). El resto de las drogas en estudio mostraron distintos grados de actividad a excepción de la tilmicosina y la enrofloxacina con un 90% (CIM ≥2) y un 100% (CIM ≥8) de cepas resistentes respectivamente. El aislamiento de cepas de campo y los estudios de CIMs son de sumo valor para la elección correcta de las terapias medicamentosas en el control de MS en las granjas avícolas.

INTRODUCCIÓN

Mycoplasma synoviae (MS) es uno de los principales patógenos de la industria avícola, causante de grandes pérdidas productivas y económicas. MS puede causar tanto infecciones subclínicas afectando el tracto respiratorio superior como también causar infecciones clínicas con signos respiratorios o sinovitis en gallinas y pavos (Kleven et al. 2003). Mantener la enfermedad bajo control o establecer un status de aves libres de MS puede lograrse mediante la aplicación de programas de controles mediante el uso de antibióticos o vacunas en complemento con un programa de bioseguridad. El problema surge cuando los veterinarios prescriben tratamientos sólo con base a los hallazgos clínicos que afectan a las parvadas, sin tener en cuenta, que en la actualidad, es cada vez más importante para el tratamiento de infecciones por MS, la realización de un antibiograma para determinar la sensibilidad de las cepas más prevalentes de la granja a los distintos antibióticos. El presente estudio se llevó a cabo para determinar la concentración inhibitoria mínima de cepas aislada de granjas de gallinas de postura comercial de la República Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS.
Cepas de Mycoplasma synoviae

10 cepas de Mycoplasma synoviae aisladas en granjas de postura comercial localizadas en la provincia de Buenos Aires, Argentina, fueron utilizadas en este estudio. Las cepas fueron obtenidas mediante hisopados traqueales, utilizando hisopos estériles de madera y algodón. Los hisopos fueron resuspendidos en 1 ml de medio de cultivo líquido de Frey y luego este medio fue filtrado a través de un filtro estéril de 0,45 μm. Se tomó una alícuota de 200 μl del filtrado y se sembró en medio sólido y líquido de Frey. Las muestras se incubaron a 37°C hasta observar crecimiento de colonias en el medio sólido o cambio de color en el medio líquido. Las colonias finalmente fueron identificadas mediante el uso de PCR (Hong et al 2004). Una vez confirmado el aislamiento se conservaron en medio líquido de Frey a -70°C.

Antibióticos

Para realizar la prueba se utilizaron placas comerciales Sensititre®, de la empresa Thermo Scientific, de 96 pocillos con fondo cóncavo en la cual se encuentran fijados los antibióticos en distinta concentraciones. Las placas utilizadas contenían Tilvalosina de 0,016 a 128 μg/ml; Enrofloxacina 0,016 a 8 μg/ml; Doxiciclina 0,06 a 16 μg/ ml; Clortetraciclina 0,5 a 16 μg/ml; Lincomicina 0.12 a 32 μg/ml; Tilmicosina 0,06 a 128 μg/ml; Tiamulina 0,016 a 32 μg/ml; Amoxicilina 0,008 a 8 μg/ml; Tilosina tartrato 0,06 a 64 μg/ml.

Medio de cultivo

Se utilizó medio de cultivo para Micoplasma sólido y líquido, descripto por Frey et al., en el año 1968 conteniendo entre sus componentes glucosa y el indicador de pH rojo de fenol. El agregado de glucosa en el medio sirve no sólo para enriquecer el crecimiento bacteriano sino también como indicador de crecimiento, ya que, debido a su fermentación se produce ácido en el medio causando que el color del medio cambie gradualmente de rojo hacia amarillo gracias al indicador de pH.

PROCEDIMIENTO

Para la obtención del inoculo se debió realizar el Conteo Viable (CV) de las cepas a evaluar mediante la determinación de las Unidades Cambiadoras de Color (UCC). Se utilizó una placa estéril de 96 pocillos de fondo cónico, en la cual se agregó 200 μl de medio de cultivo de Frey líquido en cada uno de ellos.

En el primer pocillo se inoculó 20 μl de la cepa de MS y se realizaron diluciones en base 10 hasta finalizar la línea de la placa. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada cepa. Luego la placa se cubrió con un film transparente y se incubó a 37°C durante una semana. Se determinó la UCC de la cepa evaluando el número de diluciones en las cuales se evidenció crecimiento mediante el cambio de color del medio de cultivo.

Una vez obtenida la UCC de la cepa se realizaron las diluciones necesarias para lograr una concentración de 102 a 104 Unidades Cambiadoras de Color. El método utilizado para establecer la CIM fue el de microdilución en placa descripto por Whitehar et al (1983).

Brevemente, 100 μl del inoculo fue sembrado en cada uno de las 96 pocillos de la placa Sensititre® par
lograr la concentración de los antibióticos deseada. Luego la placa se cubrió con un film transparente y se incubó por 24 horas a 37°C. Se determinó, en comparación con un medio de Frey sin inocular, el cambio de color del medio de cultivo hacia el color naranja-amarillo.

La menor concentración de antibiótico que previno el cambio de color fue considerada la menor concentración del antibiótico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

RESULTADOS

Los resultados de las CIM’s se detallan en la tabla 1 y 2. De los antibióticos evaluados, Tilvalosina mostró la mayor actividad in vitro con una CIM90 de 0,06 μg/ml, seguida por Tilosina (CIM90 = 0,25 μg/ml) y Tiamulina (CIM90 = 0,5 μg/ ml). El resto de las drogas en estudio mostraron distintos grados de activi- dad a excepción de la Tilmicosina y la Enrofloxacina con un 90% (CIM ≥2) y un 100% (CIM ≥8) de cepas resistentes respectivamente.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, las cepas de MS evaluadas mostraron diferentes grados de sensibilidad a los distintos antibióticos. Se observaron valores de CIM superiores de Tilmicosina en relación al resto de los macrólidos y una clara pérdida de la sensibilidad a la Enrofloxacina. Esto podría deberse al uso indiscriminado de éstos antibióticos en diferentes granjas sin la previa realización de un antibiograma y a la diferencia de eficacia de los antibióticos para el tratamiento de esta enfermedad. En comparación con los datos publicados por el Cerda et al., en el año 2002 se observó un claro aumento de la CIM en los antibióticos utilizados. En el presente estudio, y en concordancia con los trabajos de Cerda et al., en 2002, y de Behbahan et al., en 2008, el antibiótico Tilvalosina sigue manteniendo la menor concentración inhibitoria mínima comparada con el resto de los antibióticos y en especial al resto de los macrólidos.

Referencias

• Cerdá R. O.; Giacoboni G. I; Xavier J. A.; Sansalone P. L.; Landoni M. F In Vitro Antibiotic Susceptibility of Field Isolates of Mycoplasma synoviae in Argentina. AVIAN DISEASES 46:215–218, 2002.
• Ghaleh Golab Behbahan N.; Asasi K.; Afsharifar A.R.; Pourbakhsh S.A Susceptibilities of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviea Isolates to Antimicrobial Agents in vitro International Journal of Poultry Science 7 (11): 1058-1064, 2008.
• Hong Y., García M., Leiting L., Bencina D., Dufour-Zabala L., Zavala G. , Kleven S.H.. Specific detection and typing of Mycoplasma synoviae strains in poultry with PCR and DNA sequence analysis targeting the hemagglutinin encoding gene vlhA. Avian Dis., 48, 606–616. (2004).
• Kleven, S.H., Mycoplasma synoviae Infection. In: Saif, Y.M., H.J. Barnes, J.R. Glisson, A. M. Fadly, L.R. McDougald and D.E. Swayne (Eds.), pp: 756-766. (2003).
• Whithear, K.G., D.D. Bowtell, E. Ghiocas and K.L. Hughes,. Evaluation and use of a Micro-broth dilution procedure for testing sensitivity. Avian Dis., 27: 937-942. (1983).

Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno Octubre-Noviembre 2017