Modelos estándar para cada disciplina
MVZ, EPAP, MC. Raúl Águila.
ENLACE.
En la primera parte de este artículo he abordado el tema de los trabajos experimentales en cerdos, si bien, la mayoría de los conceptos aplican también a aves. Además, presenté una visión general sobre la ciencia. He aclarado también que estos escritos van dirigidos, no al reducido grupo de investigadores, sino a los lectores de trabajos experimentales, que somos la mayoría. Pero ahora quiero añadir una precisión: tampoco es que en nuestro gremio se lean muchos trabajos experimentales, sino que, estamos expuestos constantemente a estos temas cuando en conferencias, artículos de difusión y hasta en publicidad, nos presentan cuadros con resultados experimentales (productos comerciales generalmente) ¿Sabemos interpretarlos o dejamos que nos digan lo que quieran?
En el segundo artículo, presenté brevemente las partes del reporte de un trabajo experimental científico (introducción, material y métodos, resultados, discusión, conclusiones, implicaciones); también expliqué, para nuestra actividad de producción animal, los tipos y características de trabajos experimentales, pero no los de investigación básica, sino los de productos que proclaman mejorar el desempeño de los animales: 1) pruebas controladas y 2) pruebas de campo. Ya profundizando, introduje el concepto y gran importancia que tiene el grupo control, y es que, sin éste, no hay experimento científico.
El tema del grupo de animales control no quedó completo, y por tanto, continuaré con él; después explicaré ejemplos de diferentes modelos de trabajos experimentales y su interpretación.
LO YA EXPLICADO.
A) Tipos de pruebas.
• En pruebas con aditivos alimenticios, requerimientos nutricionales, técnicas o manejos especiales, se busca mejorar parámetros productivos que se expresan sin enfermedad clínica, o sea, todo es en animales sanos.
• En pruebas con enfermedades, realizadas en condiciones controladas, los animales son desafiados con la enfermedad, (se les inocula el microorganismo), es decir, se busca generar enfermedad para que, mediante el tratamiento experimental, se logre demostrar prevención o retorno a la salud. Las pruebas con enfermedades implican más de un grupo control (ver adelante).
B) Grupo control
• Básicamente, es el testigo neutral de la prueba, porque no recibe el tratamiento.
• En pruebas con animales sanos, el control negativo es una referencia pues, se espera que muestre resultados normales de la población.
• Dependiendo del tipo de prueba (animales sanos o enfermedad), hay varios tipos de controles: negativo, positivo, doble negativo, mixtos (negativo, positivo).
• En pruebas de campo con enfermedades, el control negativo puede ser el desempeño productivo histórico de la granja, o sea, antes de aplicar el medicamento; esto es válido cuando se quiere controlar enfermedades con antibióticos o vacunas, la razón, es que sólo hay dos opciones de resultados contundentes: se controló la enfermedad evidentemente, o la enfermedad persistió, hay numerosas parámetros para confirmar cualquiera de estos dos resultados (ganancia de peso, consumo de alimento, % de cerdos de segunda, lesiones, serología, etc.).
MÁS SOBRE CONTROLES
El control positivo debe dar un resultado conocido, incluso estandarizado. Se usa mucho en pruebas de laboratorio para análisis de alimentos y materias primas, micotoxinas, bacteriología, etcétera. Sirve para confirmar que el procedimiento se ha realizado correctamente, o bien, para confirmar resultados obtenidos en investigación previa. Por ejemplo, en pruebas de inocuidad de un medicamento, se usan conejos de laboratorio y, en uno de los ojos, se inocula ácido clorhídrico al 0.5 Normal pues, con esta concentración se sabe que el ojo se irrita, de hecho, se tienen bien estudiados y descritos los grados de irritación que se producen.
En el cuadro 1 se plantea el experimento con control positivo (inoculación de ácido clorhídrico), se espera observar la irritación del ojo; esto permite comparar con el control negativo y los tratamientos. El control negativo (ojo), al no recibir, ni el ácido clorhídrico, ni el medicamento en prueba, se muestra normal (sin irritación); con estos dos controles se podrá comparar el resultado de los 3 niveles (dosis) de medicamento. Los valores de las dosis aquí presentados solamente son un ejemplo, ya que, en la práctica, los expertos investigadores los establecen para cada experimento. En el cuadro 1, se plantean 3 respuestas posibles a las dosis: no irritación, irritación leve, irritación severa.
*HCl = Ácido clorhídrico 0.5 N (es un estándar que se sabe provoca irritación ocular, o sea, control positivo).
MODELOS DE TRATAMIENTOS Y CONTROLES.
Los modelos son precisamente la planeación del experimento científico, e implican el esquema de los tratamientos y sus controles.
Es indispensable saber contra qué se van a comparar los resultados de los tratamientos.
El cuadro 1 es precisamente un modelo experimental y, aunque podemos decir que hay lineamientos básicos generales, resulta que para cada disciplina hay estándares propios. En este artículo iré presentando algunos ejemplos de disciplinas científicas que requieren de diseños especiales: requerimientos nutricionales, materias primas, aditivos alimenticios, enfermedades, antibióticos, diversos análisis de laboratorio, toxicología, etcétera.
Además, en cada ciencia hay particularidades; ciertas pruebas de toxicología son un buen ejemplo, un ejemplo de ello: para probar si un medicamento puede ser irritante a los ojos, cuando es manejado por trabajadores, se hacen pruebas en conejos. Lo particular es que, a un ojo del conejo se le aplica cierta dosis del medicamento y, al otro ojo, se le deja como control negativo (testigo); por cierto,aquí la unidad experimental no es el conejo sino, el ojo.
Desafío infeccioso.
Otro ejemplo de uso de un control positivo se presenta en las pruebas donde se inocula un microorganismo para producir la enfermedad infecciosa (bacteria, virus, parásito), a esta acción se le denomina “desafío”.
La justificación es la siguiente: se supone que, los animales que no reciben medicación, pero que sí son desafiados con el microorganismo, van a enfermar y / o morir, lo cual será prueba de que el microorganismo inoculado: 1) Sí estaba activo, 2) Sí era patógeno, 3) Sí fue efectivo el procedimiento de infección experimental; y por tanto, se extrapola que los animales en los tratamientos con medicamento fueron verdaderamente desafiados por el microorganismo patógeno; entonces, sólo así será válido observar el efecto del medicamento ¿funcionó o no? Esta explicación resultará más clara con el cuadro 3.
EJEMPLOS DE MODELOS EXPERIMENTALES.
A continuación, se presentan y analizan algunos modelos de trabajos experimentales, en ciertas áreas de investigación, que cubren las necesidades de demostrar resultados, sin ambigüedades.
Explicación del cuadro 2.
La columna 1 mostrará los parámetros productivos del grupo de animales sanos. Indispensable.
La columna 2 era necesaria en la década de los noventa del siglo pasado, cuando apenas se iniciaba el desarrollo de secuestrantes, pues, había que comprobar que el secuestrante no afectara el crecimiento de los animales, ya que, por diversas razones, se podía sospechar de un posible “secuestro” de nutrimentos. Actualmente ya no es necesario porque ya hay mucha investigación previa sobre los principios activos, incluso a nivel de modelos computacionales tridimensionales.
La columna 3, en comparación con la 1, deberá evidenciar que sí fue posible reproducir la micotoxicosis porque los animales enfermaron al recibir la micotoxina y, no recibir el secuestrante en el alimento.
Los tratamientos (4, 5, 6), son para saber qué pasa con tres dosis preventivas de secuestrante en el alimento ¿permanecerán sanos, enfermarán? ¿A qué dosis será esto? Las conclusiones de estos tres serán válidas porque el control negativo (3), habrá demostrado que la micotoxicosis sí se deriva del sorgo contaminado, es decir, sí están neutralizando a una o varias micotoxinas potencialmente patógenas.
Desde luego que, para los desafíos, previamente debe estimarse la concentración de micotoxina capaz de producir signos clínicos y/o lesiones evidentes; también se debe tener la certeza de que dichas concentraciones de micotoxinas se encuentren en los ingredientes (sorgo, por ejemplo); y por tanto, en el alimento usado en los grupos desafiados. Generalmente se manejan concentraciones muy altas de micotoxinas para reducir el tiempo en que se presentan los signos clínicos y/o lesiones.
Se debe recordar que, tanto los controles como los tratamientos son grupos de animales, por ejemplo: 2, 5, 10, 20 cerdos, dependiendo del tipo de alojamiento (corrales colectivos) de la unidad experimental; por tanto, dentro de cada grupo desafiado, algunos animales pueden enfermar y/o morir, pero otros no. Además, también hay que evaluar el grado en que enferman. Todo esto tiene que ver con los modelos de calificación del nivel de severidad y, el análisis estadístico específico para cada experimento (trabajo multidisciplinario).
Una aclaración, el nombre control “mixto” no lo encontré en la bibliografía, pero el sentido común dicta que eso es, un grupo que combina un control positivo y un control negativo (recibe el desafío, pero no el remedio…sí micotoxina, pero no secuestrante).
La nomenclatura que estoy usando, la cual distingue control negativo, control positivo, doble negativo y doble positivo tiene como objetivo evitar confusiones.
Ya he explicado que, es vital tener los controles pertinentes para que los tratamientos se puedan comparar contra testigos neutrales, y así, generar certeza de la metodología.
Y es que, un experimento, no se vuelve científico por dar una “explicación” o pretexto por no usar un control necesario; he escuchado muchas veces: “es que no había presupuesto económico”, “es que no había espacio para otro control…”, entonces, “con la pena” no hay conclusiones válidas, no hay trabajo científico, no debería presentarse, ni publicarse. Es pérdida de tiempo para el lector de trabajos experimentales.
Explicación del cuadro 3.
La columna 1 mostrará los parámetros productivos del grupo de animales sanos. Indispensable.
El control de la columna 2 no es necesario. Aquí lo pongo por didáctica, para ilustrar su posible existencia, pero no tiene utilidad saber qué les pasa a los animales sanos al recibir el antibiótico y es que, se sabe que no les pasa nada porque previamente se han hecho pruebas exhaustivas de inocuidad (toxicidad y residuos), en animales de laboratorio e incluso en cerdos, aves. Es parte del protocolo de investigación y desarrollo de un antibiótico (normas internacionales). El grupo de la columna 3 (desafío sin tratamiento = control mixto), deberá mostrar que sí fue posible reproducir la enfermedad porque los animales enfermaron y no se les aplicó el tratamiento.
La intensidad de la enfermedad se deberá clasificar con los criterios de los investigadores expertos, por ejemplo, grado y frecuencia de signos clínicos (diarrea, tos), lesiones, morbilidad, mortalidad, etcétera.
Desde luego que debe generarse enfermedad de alta intensidad para que, sin lugar a dudas, los tratamientos médicos muestren efectividad o no.
Los tratamientos (4, 5, 6), son para saber qué pasa con tres dosis de antibiótico ¿los animales permanecerán sanos, enfermarán? ¿A qué dosis será esto? Las conclusiones de estos tres grupos serán válidas porque el control negativo (3), habrá demostrado que la inoculación de la bacteria sí es capaza de producir la enfermedad. Como ya había explicado, la enfermedad generada debe ser suficientemente grave para dilucidar si los tratamientos son verdaderamente efectivos o no, en lenguaje coloquial: “no se vale producir enfermedad leve para demostrar que un tratamiento funciona”.
Un detalle importante: las pruebas controladas con enfermedades deben realizarse en unidades aisladas para evitar que los cerdos o aves se infecten aleatoriamente vía aire, drenaje, etcétera; sobre todo los que deben permanecer sin desafío.
Por cierto, es bien sabido: hay enfermedades que, para que sean reproducidas en condiciones controladas, es necesario inocular otro agente que actúe como inmunodepresor, o con algún otro efecto que “abra la puerta” (virus, bacteria, micotoxina), a la bacteria o virus que se está estudiando; tal es el caso del trabajo clásico de los doctores Abel Ciprián y Carlos Pijoan (UNAM, FESC), que se resume en el cuadro 4. Resulta claro que, por separado, la Pasteurella multocida (Pm) y el Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) no provocan daño (2) o éste es muy poco (3); sin embargo, la combinación de ambas bacterias tiene efectos desastrosos (grupo 4).
Pm = Pasteurella multocida, Mh = Mycoplasma hyopneumoniae. GDP = Ganancia Diaria de Peso; C.A. = Conversión Alimenticia (kg de alimento por kg de peso ganado).
Adaptado de: Ciprian, A.C.; Pijoan, C.A., et al (1988) Mycoplasma hyopneumoniae Increases the Suceptibility of Pigs to Experimental Pasteurella multocida Pneumonia. Can J. Vet. Res: 52. 434-438.
Reproducir enfermedades en situaciones controladas no es sencillo, se necesitan expertos que no necesariamente son parte del equipo investigador original, es decir, habrá que pagar su asesoramiento, al igual que se hará con el experto en análisis estadístico, esto es bueno porque el trabajo multidisciplinario aumenta las probabilidades de que todo el trabajo experimental sea válido, esto independientemente de que se acepte o rechace la hipótesis.
Modelo para aditivos alimenticios.
Estos trabajos se hacen en animales sanos. Con el aditivo alimenticio se busca mejorar el desempeño productivo de los animales, generalmente durante su crecimiento.
Las variables de respuesta típicas son: la Ganancia Diaria de Peso (GDP), el Consumo Diario de Alimento (CDA), la Conversión Alimenticia (C.A.); se puede incluir rendimiento y calidad de la canal.
Experimentalmente no es fácil demostrar beneficios porque, el crecimiento de animales modernos ya de por sí es eficiente. Es lo opuesto a los experimentos con enfermedades donde, se pueden demostrar resultados contundentes cuando se logra controlar la enfermedad con una vacuna o un antibiótico.
El modelo para probar aditivos alimenticios es bastante sencillo, basta con un control negativo (sin aditivo) y el tratamiento con aditivo. Puede incluir más tratamientos si se prueban diversos niveles de dosis
Modelo para enzimas exógenas.
Las enzimas exógenas, por ejemplo, fitasas y carbohidrasas, deben liberar nutrimentos “atrapados” en los ingredientes de la dieta. En el cuadro 5 se plantea un modelo experimental que consta de: Control 1 (doble negativo, es una dieta normal que cubre los requerimientos nutricionales de cerdos en la etapa de finalización); Control 2 (negativo / positivo, es una dieta con déficit de fósforo, calcio y aminoácidos y, sin enzimas); Tratamiento, es la misma dieta con déficit de nutrimentos (control 2, pero con la adición de un paquete de enzimas exógenas).
En el cuadro 5, vemos que los resultados de GDP y C.A. del control 2 (déficit de nutrimentos y sin enzimas) fueron malos con relación al control 1, es decir, a los animales del control 2 les afectó la falta de nutrimentos; pero, el tratamiento (dieta con déficit + enzimas), mostró los mismos resultados que el control 1 (sin diferencia estadística significativa); esto se interpreta como que las enzimas liberaron los nutrimentos secuestrados en los ingredientes y, evitaron el déficit nutricional visto en los animales del control 2, por eso igualaron los parámetros de crecimiento del control 1.
Letras diferentes en el mismo renglón indican diferencia significativa P < 0.05.
Modelo para aditivos vs ABpc.
Actualmente hay diversos aditivos alimenticios que pretenden sustituir a los AntiBióticos promotores de crecimiento (ABpc), por ejemplo: fitogénicos, ácidos orgánicos, etcétera. Entonces, el diseño experimental tiene al menos dos tratamientos, el modelo debe quedar así: 1) Control doble negativo (sin ABpc y sin aditivo), 2) Tratamiento con ABpc, 3) Tratamiento con aditivo sustituto del ABpc (cuadro 6).
Al no existir grupo control es incorrecto concluir que el Aditivo “también” mejora la eficiencia.
Una falla que observo con frecuencia en estas pruebas es la omisión del control (cuadro 7). No hay un grupo control que atestigüe cómo es el crecimiento sin ABpc y sin aditivos; entonces, es un error suponer que el ABpc va a dar mejores resultados que el control (no necesariamente). Es decir, aunque el Aditivo dé el mismo resultado que el ABpc, tal vez ambos den el mismo resultado que el control. Hay duda; y por tanto, no se puede concluir que el aditivo puede sustituir al ABpc en la mejora del crecimiento.
Continuará… pero le aconsejo: la próxima vez que vea los resultados de un trabajo experimental, comience por revisar los controles ¿son los adecuados para generar confianza en los resultados? ¿los resultados son coherentes con los controles?
Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno
