Análisis de la secuencia de la proteína “Ataq” de la garrapata Rhipicephalus microplus en dos aislados mexicanos
Dr. Rodolfo Esteban Lagunes Quintanilla.
CENID-PAVET, INIFAP,
[email protected]
Colaboradores:
IBT. Francisco Javier Juárez Landa. UPEMOR,
DR. Rubén Hernández Ortiz. CENID-PAVET, INIFAP,
M. EN C. Edgar Castro Saines. CENID-PAVET, INIFAP,
M. EN C. Ninnet Gómez Romero. FMVZ-UNAM.
DRA. Gabriela Granjeno Colín. CENID-PAVET, INIFAP,
Trabajo Ganador del Primer Lugar durante el II Congreso de la Asociación de Médicos Veterinarios Zootecnistas Especialistas en Bovinos del Estado de Veracruz 2017.
INTRODUCCIÓN
La producción de ganado bovino que se desarrolla en regiones tropicales y subtropicales de México, está constantemente expuesto a las infestaciones por garrapatas Rhipicephalus microplus. Esta garrapata es un ectoparásito hematófago obligado con importancia sanitaria y económica debido a los daños directos e indirectos que ocasiona a la producción pecuaria. Actualmente, existen distintos métodos de control en campo con efectividad variable. El control químico, es el más utilizado a la fecha; sin embargo, el uso indiscriminado ha ocasionado la selección de poblaciones de garrapatas resistentes. Tal es el caso de explotaciones localizadas en regiones de Veracruz y Tamaulipas donde existe el fenómeno conocido como multiresistencia (Fernández-Salas et al., 2012). Por otro lado, el control inmunológico, se vislumbra como una alternativa sugerente que se refleja en la disminución de poblaciones de garrapatas. El estudio de genes/proteínas a partir de cepas locales de R. microplus, será una herramienta fundamental para el diseño y desarrollo de antígenos vacunales, los cuales podrían ser incorporados en un programa de control integrado contra garrapatas.
OBJETIVO
Analizar la secuencia codificante de la proteína ATAQ a partir de dos aislados mexicanos de la garrapata R. microplus, que sirva de base para el diseño de un antígeno potencial en futuros experimentos de inmunización.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron dos cepas de garrapatas R. microplus, una cepa susceptible llamada “Media joya” y otra cepa con antecedentes de uso de ivermectina, llamada “Huastecas”; ambas cepas mantenidas en el CENID-PAVET, INIFAP. Las secuencias codificantes de la proteína ATAQ de los dos aislados mexicanos fueron obtenidas de acuerdo con la metodología descrita por Juárez et al. (2016). La base de datos del GenBank se utilizó para obtener las secuencias de la proteína ATAQ reportadas para la garrapata R. microplus de distintos aislados geográficos, así como de diferentes géneros de garrapatas.
El análisis de alineamiento se realizó con el programa CLUSTAL W, disponible en el sitio http://www.genome.jp/tools/clustalw/ para localizar regiones conservadas. Se generó una matriz de sustitución para identificar el grado de identidad/similitud que existe entre los diferentes aislados geográficos de R. microplus, así como para los diferentes géneros de garrapatas, a través del servidor SIAS (http://imed.med.ucm.es/ Tools/sias.html) diseñado por la Universidad Complutense de Madrid.
El análisis filogenético se llevó a cabo usando el programa MEGA 7, para el cual se consideraron diferentes secuencias codificantes de ATAQ bajo los siguientes parámetros: como modelo de sustitución aminoacídica se utilizó el método Kimura 2 parámetros con sitios invariables (K2+l) elegido con base en el valor obtenido por el criterio de información Bayesiana. Como método de reconstrucción filogenética se utilizó el de máxima verosimilitud, como método de soporte estadístico se utilizaron 1000 réplicas de bootstrap y como grupo externo se consideró la secuencia que codifica para la proteína ATAQ de la garrapata Haemaphysalis helliptica (GU144598.1).
Cuadro 1. Matriz de identidad/similitud de las secuencias que codifican para la proteína ATAQ. El número por encima de la diagonal representa el porcentaje de identidad y por debajo de la diagonal representan el porcentaje de similitud.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | |
| 1. R. microplus “Media joya” (México) | 98.5 | 99.7 | 49.8 | 46.5 | 75.9 | 77.4 | 78.4 | 93.9 | 95.6 | 97.9 | 89.5 | 90.1 | |
| 2. R. microplus “Huastecas” (México) | 98.5 | 98.3 | 50.0 | 46.4 | 76.4 | 77.9 | 78.8 | 94.1 | 95.7 | 98.3 | 89.6 | 90.3 | |
| 3. R. microplus (Mozambique) | 99.7 | 98.4 | 49.9 | 46.7 | 76.0 | 77.6 | 78.5 | 93.8 | 95.5 | 98.0 | 89.4 | 90.1 | |
| 4. A. variegatum (Gambia) | 43.2 | 43.4 | 43.3 | 53.3 | 49.3 | 49.1 | 48.1 | 49.6 | 49.0 | 49.7 | 48.9 | 47.4 | |
| 5. H. elliptica (Sudáfrica) | 45.4 | 45.3 | 45.6 | 47.1 | 46.4 | 47.6 | 45.8 | 46.9 | 46.6 | 46.1 | 46.4 | 47.2 | |
| 6. D. variabilis (EUA) | 75.4 | 75.9 | 75.5 | 43.7 | 45.8 | 91.2 | 78.2 | 77.4 | 77.2 | 76.3 | 78.0 | 77.5 | |
| 7. D. reticulatus (Holanda) | 77.0 | 77.4 | 77.1 | 43.4 | 46.9 | 91.4 | 79.5 | 78.8 | 78.7 | 77.6 | 79.4 | 78.8 | |
| 8. H. marginatum (Francia) | 78.2 | 78.6 | 78.3 | 42.5 | 45.2 | 78.4 | 79.7 | 79.4 | 79.2 | 78.4 | 80.0 | 79.9 | |
| 9. R. evertsi evertsi (Sudáfrica) | 94.0 | 94.3 | 93.9 | 43.1 | 45.8 | 76.9 | 78.3 | 79.2 | 94.7 | 93.7 | 92.7 | 93.6 | |
| 10. R. decoloratus (Sudáfrica) | 95.7 | 95.8 | 95.6 | 42.5 | 45.5 | 76.7 | 78.2 | 79.0 | 94.8 | 95.6 | 90.2 | 90.8 | |
| 11. R. annulatus (Israel) | 97.9 | 98.3 | 98.1 | 43.1 | 45.0 | 75.8 | 77.1 | 78.2 | 93.9 | 95.7 | 89.2 | 90.0 | |
| 12. R. appendiculatus (Sudáfrica I) | 89.7 | 89.8 | 89.6 | 42.5 | 45.3 | 77.5 | 78.9 | 79.7 | 92.8 | 90.4 | 89.5 | 98.5 | |
| 13. R. appendiculatus (Sudáfrica II) | 83.9 | 84.0 | 83.8 | 43.2 | 43.5 | 72.1 | 73.3 | 74.6 | 87.0 | 84.5 | 83.7 | 91.4 |
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron del GenBank 11 secuencias de diferentes especies de garrapatas, que codifican para la proteína ATAQ, reportadas en Mozambique, Sudáfrica, Estados Unidos, Israel, Holanda, Gambia y Francia, para realizar el estudio de comparación utilizando la matriz de identidad/ similitud (Cuadro 1). El análisis mostró valores muy variables para los distintos géneros de garrapatas; mientras que para las cepas pertenecientes a la especie R. microplus fue del 98.5-99.7%. Este resultado revela un elevado grado de conservación y por ende una estructura muy similar entre los aislados mexicanos de R. microplus con el reportado en el GenBank (Mozambique: GU144589.1). La construcción del árbol filogenético muestra 5 clados o grupos estadísticamente definidos, que corresponden a los géneros: Rhipicephalus spp., Hyalomma spp., Amblyomma spp., Dermacentor spp. y Haemaphysalis spp. Ocho de las secuencias analizadas se agrupan dentro del clado de Rhipicephalus spp. mostrando una identidad de 90% entre los diferentes aislados geográficos (Fig. 1). La especie R. microplus de aislados mexicanos se agrupa en un clado bien definido con la cepa “Mozambique” y con la cepa “Israel” de R. annulatus, calculando una identidad ≥98%, lo cual sugiere que es una proteína conservada entre las especies analizadas.
La búsqueda de nuevos antígenos ha ido en avance y se han identificado nuevas proteínas con diferente mecanismo de acción, pero sólo algunas han mostrado eficacia en ensayos de inmunización contra aislados geográficamente distantes de garrapatas. La vacuna comercial a base del antígeno Bm86 demostró cierta eficacia contra R. microplus. Sin embargo, el polimorfismo del gen entre cepas de garrapatas, según la localización geográfica puede provocar ineficiencias de la vacuna ya que se ha demostrado que variaciones superiores al 2.8% en la secuencia de aminoácidos son suficientes para que el inmunógeno sea ineficaz (García-García et al., 2000). La proteína ATAQ en la garrapata R. microplus podría ofrecer el mismo efecto que el antígeno Bm86 pero con la diferencia que podría poseer un elevado grado de conservación entre los diferentes aislados geográficos (Nijhof et al., 2010). El desarrollo de un inmunógeno eficaz contra garrapatas R. microplus a base de proteínas conservadas con mínima variabilidad, podría generar una protección inmune contra especies de garrapatas de diferentes aislados geográficos y ser económicamente más viable.
CONCLUSIONES
Se analizaron las secuencias codificantes de la proteína ATAQ obtenidas de dos aislados mexicanos de R. microplus y se observó que el grado de conservación con respecto a la cepa “Mozambique” reportada en el GenBank es >98% de identidad y de similitud.
RECONOCIMIENTO
Proyecto parcialmente financiado con fondos fiscales INIFAP, N° SIGI: 11232433025.
REFERENCIAS
- Fernández-Salas A, et al. (2012). First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi-resistant to acaricides and ivermectin in the Mexican tropics. Vet Parasitol; 183: 338–342.
- García-García JC, et al. (2000). Control of ticks resistant to immunization with Bm86 in cattle vaccinated with the recombinant antigen Bm95 isolated from the cattle tick, Boophilus microplus. Vaccine; 18: 2275-2287.
- Juárez LFJ, et al. (2016). Clonación y secuenciación del gen ATAQ a partir de una cepa mexicana de la garrapata Rhipicephalus microplus. Reunión Nacional de Investigación Pecuaria. Vol. 1, Num. 1. Pp. 23-25.
- Nijhof AM, et al. (2010). Bm86 homologues and novel ATAQ proteins with multiple epidermal growth factor (EGF)-like domains from hard and soft ticks. Int J Parasitol; 40:1587-1597.
Artículo publicado en Entorno Ganadero Abril-Mayo 2017
