Agente etiológico de la enfermedad del Ojo Azul

Jossué Loeza Cortina
Universidad Veracruzana,

José Francisco Rivera-Benítez
Fernando Diosdado
Atalo Martínez
Centro Nacional de Investigación
Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.

Luis Gómez-Núñez
Centro Nacional de Investigación
Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP.
[email protected]

INTRODUCCIÓN

El Rubulavirus porcino (RVP), es un virus que pertenece a la familia Paramyxoviridae contiene un genoma de ARN de cadena sencilla de polaridad negativa (Monroe et al., 2006), es el agente que causa la Enfermedad del Ojo Azul (EOA). La EOA es una enfermedad infecto-transmisible, que sólo ha sido detectada en México, afecta de forma natural exclusivamente a los cerdos. Provoca cuadros clínicos en las diferentes etapas de la producción porcina, en los animales lactantes, el virus, ocasiona trastornos respiratorios y nerviosos, mientras que en los animales de mayor edad produce signos respiratorios. En pie de cría, es responsable de la presencia de problemas reproductivo. Se puede presentar opacidad corneal en cualquiera de estas etapas, siendo más común en animales lactantes (Kirkland et al., 2012).

En las últimas tres décadas, una de las enfermedades de los cerdos más importantes desde el punto de vista económico en la zona del Bajío Mexicano es la EOA. La EOA sigue detectándose en el territorio nacional, en diversos grados de presentación, de tal modo que en 1998, en un muestreo nacional únicamente 71 (3.9%) de casi 1,800 sueros fueron positivos, de los cuales algunos provenían de la zona endémica de la enfermedad (Guanajuato y Michoacán) (Correa et al., 1998). En otro estudio se reportó que la región de La Piedad, Michoacán, mostró una prevalencia del 28% a la EOA, mientras que otros estados del sureste fueron negativos (Martínez et al., 2011); lo que deja en claro que el hato porcino nacional se encuentra susceptible. De acuerdo con lo anterior, recientemente se aisló al RVP en cuatro granjas del estado de Querétaro (Martínez et al., 2014), estado vecino de Guanajuato. Por lo que, la EOA sigue siendo un problema sanitario en los estados de la región del Bajío.

La información genética del RVP está contenida en una molécula de ARN de una sola cadena. Posee seis genes que codifican hasta diez proteínas con funciones estructurales, reguladoras y enzimáticas (Cuadro 1) (Santos et al., 2004).

Desde su primer aislamiento, realizado a principios de 1980, a la fecha se han reportado tres grupos genéticos (1984-2006).

En estos genogrupos se han identificado cepas que producen diferentes cuadros clínicos en campo. Si bien se conoce la secuencia genética de la HN, aún queda poco definido la relación antigénica entre cepas, principalmente empleando cepas de reciente circulación.

En este estudio se realizó la caracterización genética y antigénica de nuevos aislamientos del RVP, con la finalidad de actualizar la información sobre la variabilidad del RVP, específicamente mediante el estudio de la proteína HN, la cual es encargada de unirse al receptor celular e iniciar la replicación viral, además de ser la responsable de inducir la respuesta inmune humoral en el hospedero, por lo general, neutralizante.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se realizó un muestreo en los estados de Querétaro, Michoacán y Guanajuato en los meses de enero a diciembre de 2013. El muestreo se realizó por conveniencia y en granjas de la zona, de animales con cuadro clínico sugerente a la enfermedad y de animales aparentemente sanos. Se tomaron pequeñas cantidades de órganos (tonsila, pulmón y linfonodo inguinal). Estas muestras se transportaron al Centro Nacional de Investigación Disciplinaria, en Microbiología Animal (CENID-MA), del INIFAP, en donde se procesaron, para realizar aislamiento viral y con esto poder hacer pruebas serológicas y moleculares.

Aislamiento viral

Se realizó el aislamiento viral en la línea celular de riñón de cerdo (PK-15), a partir del macerado de las muestras obtenidas en campo. El cultivo inoculado se incubó durante seis días, hasta observar la presencia de sincitios (efecto citopático). El monoestrato celular y el sobrenadante se congeló y descongeló dos veces; enseguida, se centrifugó y se extrajo el sobrenadante para su titulación por medio de hemaglutinación (Martínez et al., 2014). Para la identificación de la presencia de RVP en los cultivos celulares, se realizó una prueba de RT-PCR en tiempo real para la detección del gen N (Rivera-Benítez et al., 2013).

Titulación por prueba de Hemaglutinación

Se utilizaron placas de 96 pozos con fondo en forma de “U”. Se agregó PBS (50 μl), posteriormente se agregó virus (50 μl) y se realizaron diluciones dobles a partir de 1:2 hasta 1:1024, por último se agregaron glóbulos rojos de ave al 0.8% (50 μl), se dejó reposar por 30 min y se realizó la lectura e interpretación de resultados para la obtención del título viral de cada aislamiento y la cepa de referencia (Martínez et al. 2014).

Inhibición de la hemaglutinación

Para la identificación de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación, se utilizaron placas de 96 pozos con fondo en forma de “U”, se agregó PBS (25 μl) y se realizaron diluciones de los sueros de referencia (25 μl), iniciando desde 1:5 hasta 1: 5,120. Posteriormente, se agregó el virus (25 μl), se dejó incubar por 30 min a temperatura de laboratorio (21°C) y, por último, se agregaron glóbulos rojos de ave al 0.8% 25μl), se dejó reposar por 30 minutos y se realizó la lectura (Hernández et al., 1998).
Se utilizaron 11 sueros hiperinmunes, elaborados contra diferentes aislamientos de RVP, los cuales se inactivaron a 56°C, y se adsorbieron con caolín y eritrocitos de ave al 10% (Cuadro 2).

Caracterización genética

Con las muestras positivas por aislamiento viral, confirmadas por su capacidad hemaglutinante, se llevó a cabo la caracterización genética mediante una RT-PCR, se realizó la extracción del sobrenadante empleando el paquete comercial de extracción con columnas (Qiagen, RNeasy Mini kit) siguiendo los protocolos establecidos por el fabricante (Figura 2).


Para la caracterización genética de los aislamientos de RVP, se desarrollaron pruebas de RT-PCR para amplificar el gen que codifica para la proteína HN. Para lograr este objetivo, se analizaron secuencias del gen HN obtenidas de la base de datos del GenBank, para el diseño de iniciadores específicos y dos referidos previamente (Sánchez-Betancourto et al., 2008).
Respecto a la estandarización de la RT-PCR para el RVP en el laboratorio de virología CENID-MA, INIFAP, se diseñaron dos protocolos diferentes para amplificar los fragmentos de 1709, 1030 y 465 pb. Se utilizó el paquete comercial OneStep RT-PCR (Qiagen).

Para la secuenciación, se realizó la purificación de los productos obtenidos a partir de la reacción de RT-PCR con el paquete QIAquick PCR Purification (Qiagen), para el cual se siguió el protocolo sugerido por el fabricante. Las muestras se enviaron a la Unidad de Síntesis y Secuenciación de DNA del Instituto de Biotecnología, de la Universidad Nacional Autónoma de México.
Las secuencias de cada aislamiento fueron editadas en el programa “CodonAligner” (6.0.2). Con la edición se realizó un alineamiento múltiple en el programa “ClustalW” (2.1). En un análisis preliminar con nueve secuencias de RVP, que pertenecían a los aislamientos recientes, con el programa MEGA (6.0), se calcularon las distancias genéticas entre los aislamientos de Michoacán y Querétaro. Con las distancias genéticas se realizó un estudio de filogenia, determinando previamente el modelo más adecuado. Posteriormente, se realizó un árbol filogenético incluyendo todas las secuencias de RVP existentes en la base de datos del GenBank, (Figura 5).

RESULTADOS

Aislamiento

De 165 muestras de campo colectadas de diferentes órganos de animales con retraso en el crecimiento (pulmón, tonsila y linfonodo), se logró el aislamiento viral positivo en 17 muestras (Cuadro 3), mismo que fue corroborado por la titulación por medio de hemaglutinación (Cuadro 4) y por la técnica de RT-PCR en tiempo real, la cual amplificó un fragmento de aproximadamente 150 pb del gen N del RVP.

Prueba de inhibición de la hemaglutinación.

Ver cuadro 5.

Caracterización molecular del gen HN

Se realizaron tres pruebas para llevar a cabo la amplificación del gen HN, los cuales se comprobaron por medio de electroforesis dando los resultados que se presentan en las figuras 5, 6 y 7.

Los productos que se obtuvieron se enviaron a secuenciar, estas secuencias se analizaron con un paquete bioinformático para obtener las distancias genéticas y realizar un análisis filogenético de dos fragmentos del gen HN del RVP, un análisis de 916 pb y otro de 1581 pb.

DISCUSIÓN

En la prueba de IHA se registraron resultados muy similares con los sueros de cepas aisladas recientemente y con la cepa de referencia. Los sueros de la cepa PAC-3 registraron títulos bajos comparados con los aislamientos recientes; esto puede deberse al origen de la cepa, ya que la PAC-3 proviene del estado de Jalisco, donde es considerada endémica la enfermedad, a diferencia de Querétaro donde no es endémica.

En estudios anteriores de IHA (Rivera et al., 2009), se analizaron sueros homólogos en los cuales demuestra que existe una buena inmunidad con los sueros provenientes de la misma cepa de virus. Sin embargo, Quezada et al., 2008, en otro estudio demostraron que existe un alto porcentaje de variación, al menos de una dilución en la prueba de IHA comparando cepas heterólogas. En el presente estudio, se observó que se conserva esa relación en un alto porcentaje, al menos una dilución de diferencia con cepas que se analizaron.

En la caracterización genética, se observó que existe una diferencia de nucleótidos del 1 al 2% de las secuencias analizadas del gen HN, respecto a la cepa de referencia LPM-84, en las dos evaluaciones que se realizaron de nucleótidos el aislamiento que presentó mayor diversidad con respecto a la cepa de referencia LPM-84, fue MEX/MICH005-1/RVP/2013. En un estudio de caracterización del gen HN, Sánchez-Betancourt et al. (2007), reportaron una serie de cepas PAC en las que encontró un porcentaje de identidad con las reportadas en el GenBank de un 98.6–99.8%, lo que comparado con los resultados obtenidos demuestra que se ha conservado el porcentaje de modificaciones genéticas en el lapso de seis años.

CONCLUSIONES

Se presentaron diferencias antigénicas en las pruebas con sueros de las cepas reportadas y los aislamientos más recientes de RVP.

Se detectó la presencia de nuevas variantes genéticas del RVP.

Se logró el aislamiento de RVP en el estado de Querétaro, en donde no se tenía reportes previos de la presencia de este agente etiológico.

REFERENCIAS

  • Correa, G.P., Pérez, S.J., Martínez, L.A., Coba, A.M.A., y Córdova, L.D. 1998: Encuesta para detectar cerdos finalizados seropositivos al Rubulavirus porcino (RVP) por inhibición de la hemaglutinación (IH) y seroneutralización (SN); Mem. XXXIV R. Nal. de Invest. Pec. Querétaro, Qro.: p 218.
  • Kirkland, P.D., Stephano, A., Weingartl, H.: Paramyxoviruses. Zimmerman J, Karriker LA, Ramírez A,
    Schwartz K, Stevenson G. Diseases of swine. 10th Ed. 983.
  • Martínez, L.A.C., Carrillo, G.N., Diosdado, V.F., Córdova, L.D., Solís, H.M., Liljeult, F.F., Flores, C.R., Castillo, R. 2011: Búsqueda de anticuerpos contra el Rubulavirus porcino (RVP) de La Piedad, Michoacán, (LPM) en sueros porcinos del sureste y de centro occidente de México.; Mem. XXIV Reunión científica-tecnológica forestal y agropecuaria Veracruz y III del trópico mexicano. Xalapa, Ver., 16-19 noviembre: p. 503-506.
  • Martínez, L.A.C., Coba, A.M.A., Gómez, N.L., Diosdado, F., Córdova, D., Socci, G., Cuevas, S., Santiago, J., Carrera, E., Zapata, L.E. 2014: Isolation of BED from pigs with respiratory disease, decrease growth rates and without characteristics signs of BED.; Procc. IPVS, Cancun, Mexico. June 8-11: p. 326.
  • Monroe, S.S., Carter, M.J., Herrmann, J.E., Kurtz, J.B., Matsui, S.M. (2006): Paramyxoviridae Family. In: Büchen-Osmond C. ed. International Committee on Taxonomy of Viruses Report presented data Base Management; ICTVdB – The Universal Virus Database, version 4. Columbia University, New York, USA.
  • Rivera-Benitez, F., García, A., Reyes-Leyva, J., Hernández, J., Sánchez- Betancourt, J.I., Ramírez, M.H. 2013: Efficacy of quantitative RT-PCR for detection of the nucleoprotein gene from different porcine rubulavirus strains.; Springer- Verlag, 24 marzo: p. 171.
  • Santos L.G, Hernández J, Borraz A. M. T, Ramírez M. H, Vallejo V, Reyes L. J, 2004: Estructura, función e implicaciones patológicas de las proteínas del Rubulavirus porcino; Arch. Med. Vet. XXXVI (2): p 119 – 136.

Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno