Adriana Domínguez-Oliva,
Programa de Ciencias “Maestría en Ciencias Agropecuarias”, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco (UAM-X).
Ismael Hernández-Avalos,
Farmacología Clínica y Anestesia Veterinaria. Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (UNAM, FES-C).
Silvia A. Olmos-Hernández,
División de Biotecnología-Bioterio y Cirugía Experimental. Instituto Nacional de Rehabilitación Luis Guillermo Ibarra Ibarra (INR-LGII).
Julio Martínez-Burnes,
Grupo de Salud Animal. Universidad Autónoma de Tamaulipas, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.
Daniel Mota-Rojas
Neurofisiología del dolor y bienestar en animales domésticos y silvestres. DPAA. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco (UAM-X).
Figura 1. Las ratas de laboratorio, pieza clave para la comprensión de la biología animal y patología humana.
A pesar de que los roedores de laboratorio son de suma importancia en la ciencia biomédica, su uso constituye un tópico controversial en el que se involucran aspectos científicos, éticos, legales, morales y culturales (Franco, 2013; Laferriere y Pang, 2020). Debido a ello, desde hace 50 años se han promovido las iniciativas de reemplazo, reducción y refinamiento, con el fin de minimizar el dolor, sufrimiento y angustia de las especies empleadas en la investigación (Marquardt et al., 2018). Esto es punto clave no sólo durante la vida de los animales, sino durante los procesos de eutanasia o sacrificio humanitario al final de un protocolo experimental. Si desea consultar el artículo completo, por favor, refiérase a la versión publicada en Domínguez-Oliva, A. et al., 2022. El bienestar en roedores con fines de investigación: Historia, aspectos controversiales e implicaciones éticas. AMMVEPE 33(3), 70-79.
¿POR QUÉ ES CONTROVERSIAL EMPLEAR ANIMALES PARA EXPERIMENTACIÓN?
La controversia en torno al uso de animales en la investigación biomédica involucra criterios sociales, culturales, éticos y legales que influyen en el grado de aceptación o rechazo de algunas de estas prácticas.
Factores sociales
La opinión social respecto al uso de animales de laboratorio suele mostrar dos extremos. Por una parte, en 1989, el 75% de las personas reconocían que el uso de animales es necesario para el avance médico (Herzog, 2005); en el 2013, el 56% de los americanos lo consideraba moralmente aceptable ya que significa un avance en la medicina humana, aunque el 67% se manifestaba en contra de las pruebas de cosméticos con animales (Newport y Himelfarb, 2013). Estos porcentajes son cercanos a los reportados en España (66% a favor); sin embargo, sólo el 44% está de acuerdo que se empleen perros o primates no humanos (Goñi-Balentziaga et al., 2021). En Japón, este tipo de posturas condujo a que el uso de perros y gatos en laboratorios se redujera un 65% de 1990 a 1998 (Matsuda, 2004).
En el caso de los roedores, éstos sufren una des-animalización y des-especiación influenciada por el fenómeno de “sintiencia social” (Shapiro, 2002). Éste se conoce como una idea antropocéntrica en el que las personas aceptan la experimentación en animales que consideran con un grado de sintiencia biológica inferior, mientras protegen a aquellos animales dentro de su contexto social (Hobston-West y Davies, 2017). En una encuesta realizada en EU, la aceptación se redujo de 65 a 56% del año 2001 al 2013 (Newport y Himerlfarb, 2013). Entre los principales factores que influyen en ello se encuentra la sintiencia, alojamiento, manejo, eutanasia, y también los “fracasos” cuando los estudios con animales no pueden ser traspolados a humanos y eso conlleva al escepticismo en la ciencia (Andersen y Winter, 2019).
Los movimientos proteccionistas como la Fundación PETA (Personas para el Trato Ético de los Animales), creada en 1980, si bien no siempre son una referencia científica en el tema, su presencia en la sociedad contribuye a que el hombre se involucre e interese por el bienestar de todas las especies y, de manera indirecta, hace evidente la necesidad de estandarizar y refinar los procedimientos empleados en la experimentación, incluyendo la eutanasia (Kong y Qin, 2010).
Factores culturales
La ética se interesa en lo que es moralmente correcto; sin embargo, ésta mantiene una estrecha relación con la cultura y sociedad. Por ejemplo, algunas personas aceptan fácilmente el uso de ratas en laboratorios, ya que han crecido en un ambiente que muestra antipatía hacia las mismas al asociarlas como vectores transmisores de enfermedades (Birke, 2003). Davies (2021) menciona que la legislación y estándares sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio depende mucho de la cultura y el país del que se hable, y a esto se le conoce como “la guerra cultural” en torno a la ciencia experimental. Haciendo una comparativa entre el Reino Unido (RU) y EU, en el primero la experimentación es centralizada; es decir, el estado es el encargado de otorgar permisos; en contraste, en EU cada institución cuenta con un comité, lo que puede significar una eficiencia en tiempos, pero una carencia de completa regulación (Davies, 2021). Asimismo, la “autoridad epistémica” (quien decide si se realiza un experimento o no) va en función del criterio de la cultura de la persona y sus prioridades, si son de bienestar animal (RU) o de innovación científica y desempeño (EU) (Valverde, 2009; Davies, 2021). El Acta de Bienestar Animal, publicada en 1966 en EU, es una muestra de la influencia cultural en la ciencia. En ésta se excluye a los mamíferos del género Rattus, del género Mus, a las aves y animales de sangre fría, ya que no se consideran “animales” al ser especies reproducidas estrictamente para la experimentación, por lo cual su uso no está legislado (Paulus-Jagric, 2006).
En contraste, cuando se desarrolla la cultura del cuidado de los animales de laboratorio, se consideran las expectativas sociales humanitarias de respeto, y se implementan estrategias que van más allá de seguir meramente lo que dicta la ley (Davies et al., 2018).
Factores económicos
En la experimentación con animales existe un costo-beneficio cuando a éstos se les maneja de manera ética (European Parliament, 2002). En este sentido, la ciencia tiene dos objetivos: ser reproducible (confirmatoria de lo que ya se sabe) y que contribuya a la acumulación de conocimiento (descubrimientos). En el mundo se reporta que se emplean más de 192 millones de animales en la ciencia médica. De éstos, aproximadamente 25 millones son empleados en EU para llevar a cabo estudios clínicos o desarrollo de fármacos. El subsidio para estas prácticas se calcula hasta en 270 billones de dólares, de los cuales al menos de 13.3 a 23 billones se consideran como desperdicios cuando existen variables o resultados descontrolados (Keen, 2019). Un diseño experimental que no está bien planeado significa un desaprovechamiento financiero sin significancia que pone en riesgo la salud humana o animal, además de generar sufrimiento innecesario y la pérdida de animales (Kenehan, 2010).
En otros análisis sobre el costo de inversiones destinadas a investigaciones, Macleod y Mohan (2019) discuten que alrededor del 85% de los 300 billones de dólares anuales destinados a investigación se desperdician, y solo 1 de cada 1000 investigadores reportan a detalle las características del diseño experimental (Macleod y Mohan, 2019). Por otra parte, Van Norman (2019) calcula que el gasto total para las pruebas con animales en el 2018 fue de 7.4 billones para el descubrimiento de fármacos, 11.2 billones para ensayos preclínicos y de seguridad, 58.5 billones para el desarrollo clínico, y 2.3 billones para pruebas centrales en laboratorios (Van Norman, 2019). En México, hay 67 laboratorios y bioterios registrados frente a la SADER; del 2000 al 2018 se calcula un total de 2’332,640 animales, del cual el 98% corresponde a roedores (en su mayoría ratas) (Gil y Rodríguez, 2018). Si bien no se tiene un cálculo exacto del costo-beneficio de la experimentación, hay registros en los que se llega a invertir hasta 10 millones de pesos en adquirir y comenzar un solo proyecto (Crail, 2020).
Factores religiosos
Aunque la religión no está directamente ligada al uso de animales con fines de investigación, en algunos aspectos puede dictar la manera de realizarse dependiendo del pensamiento. En el hinduismo, constituye una ofensa y delito el emplear animales altamente venerados como las vacas o los búfalos; no obstante, la experimentación con roedores es aceptada, y en éstos se recomienda el desangramiento como un método de eutanasia, algo que no está estipulado por la AVMA (Qadri y Ramachandra, 2018). En otras religiones como el budismo y jainismo, consideran a los animales como seres sintientes con el mismo valor que los humanos, una ideología contraria al islamismo, en la que los humanos tienen derecho sobre los animales y ninguna obligación hacia ellos (Ottuh e Idjakpo, 2021). En la religión cristiana, en 1997 Haraway refirió a los roedores de laboratorio como símbolos de salvación, ya que representan el triunfo del bien sobre el mal (patologías) (Birke, 2003). En ésta se acepta la experimentación con “animales que no vivan dentro del ambiente emocional y doméstico de los humanos”, pero se debe realizar de manera ética, evitando su sufrimiento (Massaro, 2020).
Factores científicos
Dentro de la misma comunidad científica se encuentra en discusión la validez y el valor predictivo de la experimentación con animales (Singh et al., 2016). El fin de la mayoría de las investigaciones es trasladar a medicina humana el conocimiento obtenido. Sin embargo, se ha reportado que extrapolar resultados toxicológicos en animales a humanos llega a tener hasta un 90% de fracaso (Kenehan, 2010), esto debido a las diferencias biológicas entre especies (Keen, 2019), o los factores no controlados (como el estrés o dolor). Pese a ello, las pruebas de toxicidad en animales son un requisito obligatorio en la ciencia desde 1973 y contribuyen a la salud humana (Van Noorman, 2019).
TEMAS DE DEBATE Y BIENESTAR DENTRO DE LA EXPERIMENTACIÓN CON ROEDORES
El dolor
Uno de los parámetros esenciales en la evaluación del bienestar, y punto clave para el debate sobre el uso de ratas y otros animales para experimentación, es el dolor (Couto y Cates, 2019). Éste se define como “una experiencia sensorial y emocional asociada con un daño actual o potencial a tejidos”, en la cual la incapacidad de comunicarlo verbalmente no niega la posibilidad de que se perciba (Raja et al., 2020), y es parte de los lineamientos internacionales para el uso y cuidado de los animales de laboratorio, procurando un mínimo dolor y sufrimiento.
En todas las especies empleadas para la ciencia, debe instaurarse una terapia analgésica siempre que sea posible (Morton y Griffiths, 1985), ya que no aliviar el dolor se contrapone con la obligación moral de los investigadores de prevenir el sufrimiento en los animales de laboratorio, y también representa otro factor que puede alterar los biomarcadores o el comportamiento de las especies (Peterson et al., 2017).
Cuando se inicia una respuesta nociceptiva como parte de la metodología (e.g., cirugía), o como efecto secundario en alguno de los procesos de la investigación, se inicia una cascada de alteraciones orgánicas y bioquímicas, como la activación de los ejes simpático-adreno-medular o el hipotálamo-hipófisis-adrenal, con la consecuente secreción de glucocorticoides y catecolaminas que interrumpen la homeostasis de los animales (Hernández-Avalos et al., 2021). La alteración en la función inmune, biológica, neurológica y fisiológica de los roedores puede repercutir en la interpretación de los resultados debido a que se alteran parámetros fisiológicos como la frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y presión arterial, y biomarcadores como el lactato, citocinas, corticosterona, glucosa, entre otros, que pueden ser resultado del experimento en sí o respuestas adaptativas frente al dolor (Peterson et al., 2017) (Figura 2). Pese a estas consecuencias, en México se reporta que solamente el 45% de los investigadores aplican un método de analgesia durante el experimento o durante la eutanasia (Armas et al., 2018).
Figura 2. Monitorización de los parámetros fisiológicos de un paciente murino bajo anestesia inyectable. Durante procedimientos de anestesia y quirúrgicos, un correcto manejo de los animales contribuye a detectar alteraciones fisiológicas que pudieran ser derivadas de dolor.
De esta manera, es esencial implementar diversos biomarcadores, herramientas y tecnologías para identificar de manera temprana y no invasiva los signos de dolor (Morton y Griffiths, 1985), no solamente durante la vida, sino también con el fin de garantizar la calidad de muerte durante la eutanasia, proceso en el que los diferentes métodos existentes conllevan ventajas y desventajas respecto a la nocicepción (Couto y Cates, 2019).
Eutanasia
La palabra “eutanasia” se deriva de las palabras griegas “eu” – bueno – y “thanatos” – muerte – (Valentim et al., 2016). De acuerdo con las directrices internacionales y nacionales sobre la eutanasia de animales de laboratorio, el método ideal debe ser fácil, económico, seguro, y generar una pérdida rápida e irreversible de la conciencia, seguida de paro cardiaco, respiratorio y, finalmente, de una pérdida de la función cerebral con una angustia o dolor mínimo (Juaréz-Portillo et al., 2019).
Debido a que la eutanasia es el procedimiento más común, el bienestar animal se encuentra íntimamente ligado al mismo, ya que las condiciones en las que se realice influyen en gran medida en las respuestas que el organismo desencadena al término de su vida (Armas et al., 2018). Por ello, la elección del método adecuado depende de los objetivos del estudio, la necesidad de minimizar el dolor y/o la angustia de los animales, las pautas y leyes aplicables, así como la capacitación y competencia del personal (Shomer et al., 2020).
- Métodos inyectables: en éstos se incluyen la sobredosis con anestésicos, particularmente con pentobarbital (Shearer, 2018). Los barbitúricos son el método más empleado en México (29%), seguido del CO2 (10%) (Almas et al., 2018). La vía de administración es intravenosa (IV) al triple de dosis habitual. Induce una transición suave a la inconsciencia y muerte por depresión del sistema nervioso central y los centros respiratorios (Shearer, 2018). La vía intraperitoneal (IP) está aceptada por la AVMA y se recomienda por encima de los anestésicos inhalados (por razones éticas, estéticas, y de eficacia) (Laferriere & Pang, 2020). Algunas desventajas de la IP incluyen el tiempo prolongado de acción, el riesgo de producir irritación y dolor, el costo, y los residuos en la canal del animal (AVMA, 2020).
- Métodos inhalatorios: los principales son el CO2 y los anestésicos inhalados. Ambos requieren de una cámara de inducción en la que el anestésico se administra en forma de gas o líquido (AVMA, 2020). El CO2 es uno de los métodos más empleados en laboratorios. Sin embargo, debido a que genera muerte por hipoxia, se han reportado efectos adversos como vocalizaciones de baja frecuencia (asociadas a eventos estresantes) debido a un potencial miedo, ansiedad, dolor y angustia antes de la inconciencia (Améndola y Weary, 2020).
Los anestésicos inhalatorios, a pesar de ser una alternativa al CO2, también presentan limitantes. El isoflurano, por ejemplo, ha mostrado generar aversión en roedores y alterar los procesos celulares en tejidos (Bekhbat et al., 2016); por ello, los métodos físicos suelen optarse. - Métodos físicos: en éstos se incluyen la decapitación y la dislocación cervical. En la primera, la guillotina interrumpe de manera inmediata el flujo sanguíneo al cerebro, generando anoxia y muerte (Pierozan et al., 2017). Se considera el método de eutanasia más rápido y humano para roedores, sin generar alteraciones bioquímicas, pero se ha sugerido que la actividad cerebral puede preservar segundos después de la decapitación (Rijn et al., 2011). Por otra parte, la dislocación cervical es el método físico más empleado en México (Almas et al., 2018); sin embargo, requiere de entrenamiento para llevarlo a cabo de manera correcta y no generar dolor (Carbone et al., 2012).
Estudios recientes de Domínguez-Oliva et al., han mostrado que existen nuevas técnicas para evaluar la eficacia y grado de dolor durante la aplicación de eutanasia, los cuales se plantean como una alternativa para solucionar la controversia en torno a ellos (Figura 3).
Figura 3. Métodos no invasivos para evaluar la respuesta térmica superficial en eutanasia con agente inhalatorios.
PERSPECTIVAS Y OPORTUNIDADES EN TORNO AL BIENESTAR DE ROEDORES EMPLEADOS EN LA INVESTIGACIÓN
Debido a la obligación moral, ética, cultural, social y científica que los investigadores tienen sobre los roedores de laboratorio, se han adoptado herramientas no invasivas para evaluar el dolor y el bienestar de los animales. En primera instancia, la termografía infrarroja (IRT) es una técnica que detecta la temperatura superficial corporal, derivada de la microcirculación dérmica (Casas-Alvarado et al., 2019), y asocia sus cambios a emociones positivas inducidas por el juego, ejercicio o aumento en la actividad metabólica (Weitkamp, 2020), pero también a estados negativos como dolor, estrés, inflamación, miedo, o procesos de hipotermia o hipertermia, endotoxemia, inflamación, isquemia e hipoperfusión sanguínea, y eficacia analgésica (Mota-Rojas et al., 2021) (Figura 4).
Figura 4. Evaluación a través de la IRT en ratas bajo estrés térmico por transporte. Mediante la IRT se puede determinar el efecto que la movilización de animales ejerce sobre su fisiología. Debido a que el transporte es uno de los estresores principales en cualquier especie de laboratorio, el estudio de la temperatura irradiada permite establecer las posibles afectaciones a su sistema termorregulador y, por ende, a la salud.
Por otro lado, la codificación de las expresiones faciales de los animales ha llevado a desarrollar las “escalas de muecas” en ratas (Rat Grimace Scale – RGS –) y otras especies (Sotocinal et al., 2011). La RGS es un sistema de puntuación (del 0 al 2, donde 0 es dolor ausente, 1 es moderado, y 2 es severo) empleado para cuantificar el dolor empleando cuatro Unidades de Acción Facial: 1) Ajuste orbital; 2) Aplanamiento de la nariz y mejillas; 3) Posición de las orejas; y 4) Posición de bigotes (Sperry et al., 2018).
Otras técnicas no invasivas que se han implementado son cuantificar los cambios en el peso corporal, las concentraciones de metabolitos de cortisol fecal, la presentación de conductas naturales como el acicalamiento y el anidar, y aquellas encaminadas a promover estados positivos (Abdelrahman et al., 2019; Turner, 2020), como las técnicas de cosquillas en las ratas que imitan el comportamiento de juego heteroespecífico y mejoran su estado mental. De igual manera, los registros de vocalizaciones ultrasónicas han permitido asociar las de alta (~50 kHz) y baja frecuencia (~22 kHz) a estímulos positivos como el juego, o a estímulos negativos como el dolor, respectivamente. 101 (Coffey et al., 2019).
El enriquecimiento ambiental aplicado en las ratas de laboratorio es otra estrategia que mejora la capacidad cognitiva y de aprendizaje; sin embargo, requiere estandarizarse para asegurar su valor científico (Cortese et al., 2018). Implementar estas nuevas alternativas promueve el bienestar de los animales, refina los procedimientos y, con ello, mejora la calidad de los resultados obtenidos.
CONCLUSIONES
Debido a sus trascendentales aportaciones, el empleo de animales se debe realizar considerando factores sociales, culturales, éticos, económicos y científicos, con el fin de minimizar el sufrimiento, evitar el dolor innecesario y preservar la calidad de vida/muerte. Estos factores han contribuido al desarrollo de legislaciones, guías y nuevas estrategias de evaluación no invasiva (como la IRT o la RGS) que contribuyen a garantizar su bienestar para promover un uso y cuidado apropiado de los roedores de laboratorio.
REFERENCIAS
- Herzog HA. The moral status of mice. Am Psychol 1988; 43: 473–4.
- Newport F, Himelfarb I. In U.S., Record-High Say Gay, Lesbian Relations Morally OK. (19 de septiembre de 2021). https://news.gallup.com/poll/162689/record-high-say-gay-lesbian-relations-morally.aspx.
- Shapiro K. A rodent for your thoughts: The social construction of animal models. En: Henninger-Voss M (Ed.) Animals in Human Histories. United States: University of Rochester Press; 2002: pp. 439–69.
- Kong Q, Qin C. Laboratory animal science in China: current status and potential for the adoption of three R alternatives. Alt Lab Anim 2010; 38(1): 53–69.
- Birke L. Who—or What—are the rats (and mice) in the laboratory. Soc Anim 2003; 11(3): 207–24.
- Valverde M. Law’s Dream of a Common Knowledge. United States: Princeton University Press, 2009.
- Paulus-Jagric D. Of Birds, rats and mice: The protection of laboratory animals in US federal law. Leg Inf Manag 2006; 6(3): 181–7.
- Davies G, Greenhough B, Hobson-West P, & Kirk RG. Science, culture, and care in laboratory animal research: Interdisciplinary perspectives on the history and future of the 3Rs. Sci Tech Hum Values 2018; 43(4): 1–19.
- European Parlament. On Directive 86/609 on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes (2001/2259(INI)). (10 de septiembre de 2021). https://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?pubRef=-//EP//TEXT+REPORT+A5-2002-0387+0+DOC+XML+V0//EN&language=ro
- Keen J. Wasted money in United States biomedical and agricultural animal research. En: Herrmann K, Jayne K (Eds.). Animal Experimentation: Working Toward a Paradigm Change. Netherlands: Brill; 2019.
- Kenehan S. The moral status of animal research subjects in industry: A stakeholder analysis. En: Herrmann K, Jayne K (Eds.). Animal Experimentation: Working Towards a Paradigm Change. Netherlands: Brill; 2010: pp. 209–23.
- Van Norman GA. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: is it time to rethink our current approach?. J Am Coll Cardiol Basic Trans Science 2019; 4(7): 845–54.
- Gil G, Rodríguez X. Bioterios en México. 20 años de caos y riesgo, (30 de septiembre de 2021). https://www.connectas.org/especiales/bioterios-en-mexico/
- Crail, A. La desgracia de los cuyos. 10 millones en animales para experimentación. (30 de septiembre de 2021). https://www.m-x.com.mx/al-dia/la-desgracia-de-los-cuyos-mexico-gasta-10-millones-en-animales-para-experimentacion
- Qadri SS, Ramachandra SG. Laws, regulations, and guidelines governing research animal Care and use in India. En: Laboratory animals. United States: Academic Press; 2018: 237–61.
- Ottuh P, Idjakpo OG. Animal Care and Ethics in Contemporary Religious Debates. J Sosialisasi 2021; 1(1): 128–41.
- Massaro A. Understanding animal research in the light of Christian animal ethics. Marb J Relig 2020; 22(2): 1–11.
- Singh VP, Pratap K, Sinha J, Desiraju K, Bahal D, Kukreti R. Critical evaluation of challenges and future use of animals in experimentation for biomedical research. Int J Immunopathol Pharmacol 2016; 29(4): 51–61.
- Couto M, Cates C. Laboratory guidelines for animal care. En: Pelegri F (Ed). Vertebrate Embryogenesis. United States: Springer; 2019: 407–30.
- Raja SN, Carr DB, Cohen M, Finnerup NB, Flor H, Gibson S et al. The revised International Association for the Study of Pain definition of pain: concepts, challenges, and compromises. Pain 2020; 161(9): 1976–82.
- Morton DB, Griffiths PH. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and a hypothesis for assessment. Vet Rec 1985; 116(16): 431–6.
- Peterson NC, Nunamaker EA, Turner PV. To treat or not to treat: the effects of pain on experimental parameters. Comp Med 2017; 67(6): 469–82.
- Hernández-Avalos I, Flores-Gasca E, Mota-Rojas D, Casas-Alvarado A, Miranda-Cortés AE, Domínguez-Oliva A. Neurobiology of anesthetic-surgical stress and induced behavioral changes in dogs and cats: A review. Vet World 2021; 14(2): 393.
- Valentim AM, Guedes SR, Pereira AM, Antunes LM. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Anim 2016; 50(4): 241–53.
- Shomer NH, Allen-Worthington KH, Hickman DL, Jonnalagadda M, Newsome JT, Slate AR et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci 2020; 59(3): 242–53.
- Shearer JK. Euthanasia of cattle: Practical considerations and application. Animals 2018; 8(4): 57.
- Améndola L, Weary DM. Understanding rat emotional responses to CO 2. Transl Psychiatry 2020; 10(1): 1–12.
- Bekhbat M, Merrill L, Kelly SD, Lee VK, Neigh GN. Brief anesthesia by isoflurane alters plasma corticosterone levels distinctly in male and female rats: Implications for tissue collection methods. Behav Bran Res 2016; 305: 122–5.
- Pierozan P, Jernerén F, Ransome Y, Karlsson O. The choice of euthanasia method affects metabolic serum biomarkers. Basci Clin Pharmacol Toxicol 2017; 121(2): 113–8.
- Rijn CMV, Krijnen H, Menting-Hermeling S, Coenen AM. Decapitation in rats: latency to unconsciousness and the ‘wave of death’. PloS One 2011; 6(1): e16514.
- Carbone L, Carbone ET, Yi EM, Bauer DB, Lindstrom KA, Parker JM et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim 2012; 51(3): 352–6.
- Casas-Alvarado A, Mota-Rojas D, Hernández-Avalos I, Mora-Medina P, Olmos-Hernándeez A, Verduzco-Mendoza A, Reyes-Sotelo B, Martínez-Burnes J. Advances in infrares thermography: Surgical aspects, vascular changes, and pain monitoring in veterinary medicine. J Therm Biol 2020; 92: 102664.
- Weitkamp J. Effect of tickling and gentling on eye and tail temperature of laboratory rats during manual restraint, using infrared thermography (Master’s thesis). Utrecht University, 2020.
- Mota-Rojas D, Olmos-Hernández A, Verduzco-Mendoza A, Lecona-Butrón H, Martínez-Burnes J, Mora-Medina P, Orihuela A. Infrared thermal imaging associated with pain in laboratory animals. Exp Anim 2021; 70(1): 1–12.
- Sotocinal SG, Sorge RE, Zaloum A, Tuttle AH, Martin LJ, Wieskopf JS et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain 2011; 7: 55.
- Sperry MM, Yu YH, Welch RL, Granquist EJ, Winkelstein BA. Grading facial expression is a sensitive means to detect grimace differences in orofacial pain in a rat model. Sci Rep 2018; 8(1): 13894.
- Abdelrahman A, Kumstel S, Zhang X, Liebig M, Wendt EHU, Eichberg J et al. A novel multi-parametric analysis of non-invasive methods to assess animal distress during chronic pancreatitis. Sci Rep 2019; 9(1): 1–13.
- Turner PV. Moving Beyond the Absence of Pain and Distress: Focusing on Positive Animal Welfare. ILAR J 2020; ilaa017: 1–7.
- Coffey KR, Marx RG, Neumaier JF. DeepSqueak: a deep learning-based system for detection and analysis of ultrasonic vocalizations. Neuropsychopharmacology, 2019; 44(5): 859–68.
- Cortese GP, Olin A, O’Riordan K, Hullinger R, Burger C. Environmental enrichment improves hippocampal function in aged rats by enhancing learning and memory, LTP, and mGluR5-Homer1c activity. Neurobiol Aging 2018; 63: 1–11.