Como base de la generación de nuevas estrategias efectivas de inmunización contra Coccidia Aviar.

MVZ. MC. Marco Antonio Juárez Estrada.
Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves F.M.V.Z.-U.N.A.M.
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La invasión celular del enterocito en la gallina doméstica (Gallus gallus) por parte de los diferentes estadios de Eimeria spp. son activos, únicos y efectivos, por lo cual es imprescindibles conocerlos puntualmente con la finalidad de poder generar estrategias de inmunización que generen una protección eficaz contra los efectos nocivos de este tipo de parásito que es el de mayor importancia en la avicultura comercial mexicana.

Los estados invasivos asexuales de E. tenella (esporozoitos y merozoitos), son células altamente polarizadas que tienen estructuras clásicas compartidas por todos los miembros de apicomplexa, los cuales incluyen organelos secretorios especializados (micronemas, roptrias y gránulos densos) en la parte apical de su estructura.

La invasión es un proceso multietápico activo que inicia con la reorientación y adhesión de la parte apical del parásito a la membrana citoplasmática del huésped (Figura 1), seguida por una rápida y progresiva internalización acompañada por la formación de una vacuola parasitófora intracelular en la cual el parásito invasor comienza su replicación por medio de división celular múltiple.

Aunque algunos de los eventos de adhesión e invasión se encuentran ya en estudio avanzado, la identificación de proteínas de superficie en miembros de apicomplexa aún no se encuentra bien dilucidada. En E. tenella dentro de los componentes proteícos de los organelos secretorios como micronemas (MIS´s) se han encontrado adhesinas potenciales, algunas de las cuales son proteínas transmembranales.

En otros miembros de apicomplexa como Cryptosporidium parvum, Plasmodium sp. y Toxoplasma gondii, las mayores moléculas sobre la superficie de estos parásitos invasivos son proteínas ancladas por medio de móleculas de tipo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).

En contraste a las proteínas transmembranales las cuales se almacenan dentro de los organelos secretorios antes de ser trasladadas a la superficie del parásito al momento del proceso activo de invasión después del anclaje. En apicomplexa las proteínas ancladas-GPI son dirigidas rápidamente de la red trans-golgi a la membrana citoplasmática. Se ha propuesto una serie de funciones para este tipo de proteínas ancladas-GPI de superficie, dentro de las cuales se consideran como ligandos de unión (Por ejemplo, proteína circumesporozoito, CSP, de Plasmodium spp., proteína de superficie del merozoito 1, MSP1 de Plasmodium sp.; antígeno de superficie 3, SAG3, de T. gondii) y zoito de maduración (CSP de Plasmodium berghei).

En el caso de Eimeria sp., no se han caracterizado a detalle proteínas ancladas por medio de GPI, sin embargo, se ha observado que E. tenella posee proteínas asociadas de membrana, las cuales se solubilizan cuando se trata la membrana con una fosfolipasa C fosfatidil-inositol-específica (PI-PLC).

Debido a que las proteínas reaccionan con anticuerpos contra determinantes que cruzan con carbohidratos de una glicoproteína variante de superficie de Trypanosoma brucei sensible a la PI-PCL, la adhesión a la membrana de proteínas sensibles a PI-PLC de E. tenella es más probable que se efectúe a través de un anclaje del tipo GPI. Además, la TA4, que es una proteína de superficie del esporozoito de E. tenella descrita ya previamente, muestra una secuencia carboxi terminal corta de tipo hidrofóbico que posee toda la apariencia necesaria para ser en sí una señalización para la adhesión de un anclaje tipo GPI.

Recientemente se ha generado una gran cantidad de secuencia de datos de ADN derivada de esporozoitos y merozoitos de segunda generación de E. tenella, los cuales incluyen más de 28,550 secuencias expresadas de tipo tag (EST’s), el análisis de estas secuencias de E. tenella ha permitido ya la identificación y caracterización de dos familias multi-gen de antígenos de superficie variante ligadas a GPI, las cuales se ha observado se regulan de forma diferenciada.

Invasión activa de los esporozoitos a los enterocitos

Todas las especies de Eimeria son apicomplexa, los cuales son parásitos intracelulares obligados muy exitosos, su ciclo de vida es directo de tipo monoxénico. A diferencia de otros microorganismos intracelulares que se basan en rutas de interiorización e invasión por parte del huésped, donde éste facilita la invasión a través de eventos como fagocitosis o pinocitosis, los parásitos de tipo apicomplexa invaden a las células del huésped de forma activa y rápida, lo cual en gran medida se encuentra regulado y dirigido por el parásito mismo (Santos y Soldavi-Favre, 2011).

Figura 1. Polo apical de un esporozoito de Eimeria sp en contacto de unión irreversible con las microvellosidades intestinales de las células huésped.

La principal fase infectante de los protozoarios de tipo apicomplexa como E. tenella es el esporozoito, el cual a nivel de mucosa intestinal utiliza una serie de elementos que aunque algunos de ellos se han estudiado desde el punto de vista celular, bioquímico, molecular e inmunológico, se desconocen aún exactamente cuáles son los principales elementos involucrados en los eventos de invasión primaria, además, de no saber exactamente cómo se realiza este proceso a nivel de la membrana citoplasmática de los enterocitos y cómo se logra la posterior replicación en el interior de la célula, sin mostrar un evento de resistencia efectivo por parte del sistema linfoide asociado al intestino (GALT) del ave en esta fase de invasión parasitaria primaria.

El segundo estado asexual del parásito involucrado en la replicación binaria del parásito lo constituye el merozoito, estructura que puede ser de primera, segunda e incluso tercera generación, sin entender hasta hoy en día con exactitud, cómo se lleva a cabo el proceso invasivo adyacente a las células primariamente invadidas por los esporozoitos y los eventos genómicos que regulan este proceso. Aunque información generada recientemente comienza a dar luz a este tipo de eventos, por ejemplo, se ha observado que la interacción inicial con las células del huésped puede ocurrir cuando el parásito que se encuentra en la luz intestinal en cualquier orientación con relación a la superficie de la membrana celular pero preparado para invadir, logra que su polo apical entre en contacto con la superficie celular del huésped a través de movimientos deslizantes y ondulatorios generados en su propia superficie celular, una vez hecho el contacto éste es de tipo irreversible (Figura 1).

Durante la invasión, los parásitos apicomplexa se unen a la célula huésped a través del complejo apical, una estructura característica que se encuentra en la parte extrema más fina del esporozoito (Fig. 2), este complejo apical está compuesto de un conoide, un anillo polar, microtúbulos subpeliculares y organelos secretorios como micronemas, roptrias y gránulos densos.

(a)

(b)

Figura 2. Complejo apical del esporozoito de E. tenella mostrando los organelos secretorios involucrados en el proceso de invasión, micronemas, roptrias y gránulos densos. (a) Esquema, (b) Microfotografía electrónica.

Una vez hecho el contacto entre el polo apical del esporozoito y la membrana citoplasmática del enterocito, inicia la formación de una estructura que favorece la unión o adhesión del esporozoito a la membrana de la célula huésped, la cual se conoce como unión móvil de adhesión (Moving Juction, MJ), la cual comienza a originarse conforme el proceso de invasión avanza, a través de una fuerte contracción que ocurre entre el parásito y la membrana celular del huésped, la membrana comienza a migrar plegándose hacia la parte posterior del parásito (Besteiro et al, 2011).

El parásito sintetiza complejos moleculares especializados que contribuyen a la invasión durante la interfase de interacción primaria entre el parásito y el huésped, los cuales se ha observado son esenciales para los movimientos de deslizamiento hacia el citosol de la célula invadida (glideosoma actinomiosina-dependiente) y la formación del complejo MJ. Estos complejos son ensamblados a través de una secreción regulada por las proteínas del micronema (MIC) y las roptrias (RONs/ROPs), estos componentes interactúan con el motor del parásito, el cual se localiza en la película o biofilm que rodea al esporozoito y con los receptores específicos que se encuentran sobre la superficie de la célula.

Los micronemas son pequeños organelos unidos a la membrana localizados inmediatamente debajo de la membrana del esporozoito cercana a la parte anterior extrema del complejo apical, se caracteriza por liberar numerosas proteínas solubles transmembranales.

Conforme el parásito se impulsa así mismo hacia adelante, los complejos de adhesión que se unen a la superficie se liberan paulatinamente por medio de proteólisis. Existen otras proteínas derivadas en gran parte de las roptrias que son secretadas dentro de la célula huésped (RONs/ROPs), estas contribuyen a la formación de la vacuola parasitófora la cual se encuentra asociada a la membrana celular del huésped, estas proteínas también contribuyen a modificar el ambiente intracelular del huésped. Se sabe que los micronemas y las roptrias son esenciales para la invasión, sin embargo, se han caracterizado muy pocas proteínas en ambos organelos (Tomley, 1997). Las proteínas de los micronemas se encuentran involucradas en múltiples interacciones entre el parásito y las células del huésped, específicamente relacionados con la motilidad, unión, reconocimiento y penetración celular.

Proteínas vinculadas con la invasión del parásito a las células huésped del ave

La invasión inicia cuando después de la reorientación del polo apical hacia la superficie de la membrana celular permite que el esporozoito se una a ésta formando una zona de adhesión muy fuerte, el parásito pasa entonces a través de esta zona e ingresa a la vacuola parasitófora que se forma en el citoplasma de la célula huésped, el proceso de invasión se completa en tan sólo 5-10 segundos, durante este tiempo la secreción de micronemas, roptrias y gránulos densos es secuencial y precisa. Primero los micronemas secretan su contenido, estos se encuentran involucrados primero en el reconocimiento, después en la unión a la célula huésped y posteriormente en la motilidad durante la penetración activa a la célula.

De forma posterior a la liberación del contenido de proteínas de los micronemas sigue la liberación de las proteínas de las roptrias, las cuales se cree que ayudan al movimiento del parásito hacia el interior de la célula huésped y contribuyen a la formación de la membrana de la vacuola parasitófora. Finalmente, los gránulos densos secretan su contenido proteíco, el cual tiene acción sobre la remodelación de la vacuola parasitófora inmediatamente después de la invasión.

En el caso de E. tenella se han identificado cinco proteínas de los micronemas, adicionalmente, haciendo homología con las proteínas de otros miembros de apicomplexa se han descrito otras cinco proteínas putativas. Algunas de las proteínas micronemales ya han sido descritas en su secuencia e incluso algunas han sido clonadas y utilizadas en ensayos de inmunoprotección utilizándolas como inmunogenos in ovo (EtMIC2) (Ding et al., 2004), y estudios de proteómica (EtMIC2, EtMIC3 y EtMIC4) (Tomley et al., 1996; Tomley et al., 2001; Labbé et al, 2005), sin embargo, aún se requieren más estudios para determinar su papel secuencial durante el reconocimiento, adhesión e invasión a la célula por medio de la caracterización de la proteólisis progresiva que éstas sufren como ya se ha descrito en otras proteínas de los micronemas que forman complejos en parásitos apicomplexa estrechamente relacionados con Eimeria sp. como lo es Toxoplasma goondi.

Muchas de las proteínas caracterizadas de los micronemas de apicomplexa contienen dominios de tipo adhesivo, dentro de los cuales se incluye el dominio de la trombospondina tipo I (TSP-I), dominios de inserción de integrina tipo I, dominios del factor de crecimiento epidermal (EGF) y dominios tipo manzana (Apple). La presencia de estos dominios indica que estas proteínas micronemales pueden estar jugando un papel muy importante en la unión e invasión a la célula huésped.

Las proteínas de los micronemas también se encuentran implicadas en la motilidad de los esporozoitos de E. tenella. Se ha observado que después de su secreción in vitro, las proteínas micronemales cubren hacia atrás la superficie del parásito y se liberan desde la parte posterior de la célula. Este encubrimiento o encapuchado se previene cuando se aplica citochalasina D, el cual es un inhibidor de la polimerización de actina. Por lo cual, se ha hipotetizado que después de la secreción, las proteínas micronemales que se encuentran sobre la superficie del parásito forman una conexión con la red subpelicular de actina- miosina, las cuales actúan regularmente como el motor del esporozoito.

Una característica morfológica principal del phylum apicomplexa al cual pertenece E. tenella, es la presencia del complejo apical, compuesto por micronemas, roptrias, 1 a 3 anillos polares electrodensos y un conoide dentro de los anillos que muestra una apariencia de cono truncado y 16 microtúbulos en espiral.

Dentro de la estructura morfológica principal de los esporozoitos asociada a los procesos de invasión celular se encuentran las roptrias, las cuales son de 1 a 8 organelos que se localizan en la parte apical de los organismos de los estadios asexuales invasivos de los parásitos de tipo apicomplexa. Las roptrias se encuentran en el conoide del esporozoito y tienen una forma aguda que desemboca en el extremo anterior del esporozoito, las roptrias observadas al microscopio óptico muestra una figura de huso de tipo electrodenso, las roptrias aparentemente están recubiertas de membrana, contienen material granular densamente empacado, se cree que la mayor parte de este contenido son enzimas de tipo proteolítico. El contenido de las roptrias se secreta a través de la punta apical del parásito dentro de la vacuola parasitófora al momento de la invasión celular (RONs/ROPs), se cree que estos componentes juegan un papel crítico en el proceso de invasión.

Todos los miembros de tipo apicomplexa son parásitos intracelulares obligados, los cuales ingresan a las células por medio de una serie de pasos que incluyen la desestabilización de la membrana de la célula huésped, contribuyen a la formación de una vacuola parasitófora intracitoplasmática que rodea al parásito que se encuentra invadiendo a la célula. Si bien, los parásitos apicomplexa despliegan una gran variedad de tropismo hacia diferentes tipos de células huésped, es probable que los mecanismos que utilizan para invadir a las células se encuentran bien conservados dentro del mismo tipo de parásitos apicomplexa, por lo cual se ha asumido que la interacción del contenido de las roptrias con las células huésped puede ser muy similar entre ellos.

Sin embargo, a pesar de la similitud morfológica y presuntivamente también de la misma funcionalidad conservada de las roptrias, el análisis bioquímico y molecular de un número limitado de proteínas contenido en el interior de las mismas ha indicado una falta de consistencia en la homología y especificidad de las roptrias entre diferentes géneros de una misma especie, aun cuando se ha notado que existe un número limitado de oligopéptidos de tipo semiconservado entre las proteínas Pf83/Pk66 de Plasmodium sp. y la proteína RAP-1 de Babesia sp. (Suarez et al, 1994).

Se han purificado roptrias de varios parásitos apicomplexa y han mostrado contener una mezcla compleja de polipéptidos. Estudios basados en perfiles electroforéticos de proteínas totales de las roptrias hechos en una y dos dimensiones, indican que las roptrias de varios géneros de parásitos apicomplexa aparentemente comparten de grosso modo una organización similar. Por ejemplo, se ha observado que los polipéptidos en forma de clusters migran en un rango de 45 a 65 kDa, y todas las roptrias poseen un número de proteínas de alto peso molecular.

Los polipéptidos de las roptrias purificadas de esporozoitos de E. tenella se han separado en geles de electroforesis de dos dimensiones (O´Farrel, 1975), mostrando al menos 60 spots de polipéptidos denostando una complejidad similar a las roptrias de los taquizoitos de Toxoplasma gondii (Leriche y Dubremetz, 1991). Se requiere una caracterización extensiva de genes que codifican para todas las proteínas de las roptrias de cada uno de los géneros de apicomplexa con la finalidad de determinar si existen secuencias conservadas que sean claves dentro del proceso de invasión y que por lo mismo sean factibles para poder diseñar y generar inmunógenos que eviten la infección activa del parásito por medio de una respuesta inmune efectiva del GALT del ave posterior a la inmunización específica con este tipo de estructuras moleculares.

LITERATURA CONSULTADA

– Belli, S.I., Ferguson, D.J.P., Katrib, M., Slapetova, I., Mai, K., Slapeta, J., Flowers, S.A., Kate B. Miska, K.B., Tomley, F.M., Shirley, M.W., Wallach, M.G., and Smith, N.C. (2009). Conservation of proteins involved in oocyst wall formation in Eimeria maxima, Eimeria tenella and Eimeria acervulina. International Journal for Parasitology 39, 1063-1070.

– Besteiro, S., Dubremetz, J.F., and Lebrun, M., (2011). The moving junction of apicomplexan parasites: a key structure for invasion. Cellular Microbiology 13, 797–805.

– Bumstead, J.M., and Tomley, F.M. (2000). Induction of secretion and surface capping of microneme proteins in Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology 110, 311-321.

– Bromley, E., Leeds, N., Clark, J., McGregor, E., Ward, M., Dunn, M.J., and Tomley, F. (2003). Defining the protein repertoire of microneme secretory organelles in the apicomplexan parasite Eimeria tenella. Proteomics 3, 1553-1561.

– Brothers, V.M., Kuhn, I., Paul, L.S., Gabe, J.D., Andrews, W.H., Sias, S.R., McCaman, M.T., Dragon, E.A., and Files, J.G., (1988). Characterization of a surface antigen of Eimeria tenella sporozoites and synthesis from a cloned cDNA in Escherichia coli. Molecular Biochemical Parasitology 28, 235–247.

Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno