Dr. Alejandro Córdova Izquierdo
Departamento de Producción Agrícola y Animal.
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco.
[email protected]

Román Espinosa-Cervantes
Departamento de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco.

Juan Eulogio guerra Liera
Facultad de Agronomía.
Universidad Autónoma de Sinaloa.

Adrian Emmanuel Iglesias-Reyes
Maestría en Ciencias Agropecuarias. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco.

Rubén Huerta Crispín
Abel E. Villa-Mancera
Maximino Méndez Mendoza
Facultad de Veterinaria. Benemérita Universidad autónoma de Puebla.

Blanca Estela Rodriguez Denis
Nutríologa práctica privada.

RESUMEN

El estrés oxidativo en espermatozoides, puede ser definido como el daño que sufren los espermatozoides después de que son eyaculados; cuya presencia es debido a la generación de grandes cantidades de especies reactivos al oxígeno, conocidas como ROS y que se forman cuando el espermatozoide está en desventaja para regular su metabolismo de forma natural. Las ROS causan daño en la membrana del espermatozoide, disminución de la motilidad, alteraciones de sus estructuras vitales como componentes citoplasmáticos, principalmente al material genético (ADN) y por lo tanto, incapacidad para llevar a cabo la fecundación del ovocito de manera normal. Esto provoca pobre desarrollo embrionario y baja fertilidad.

Sin embargo, pequeñas cantidades de ROS son necesarias para mantener la función normal de los espermatozoides sin rebasar el sistema antioxidante del propio espermatozoide. Por lo que la determinación del estrés oxidativo o presencia de ROS en espermatozoides de eyaculados, podría ser una herramienta diagnóstica a considerar en la identificación de la etiología de la infertilidad del macho reproductor. En este trabajo, se hace una pequeña revisión del estrés oxidativo en espermatozoides, efecto de las ROS en la motilidad espermática y ADN, y algunas técnicas para diagnosticar la presencia de ROS en espermatozoides.

ESTRÉS OXIDATIVO EN ESPERMATOZOIDES

La gran paradoja de la respiración aeróbica es que el oxígeno, es esencial para la producción de energía en muchos tipos de células incluyendo los gametos. Sin embargo, también es dañino debido a que produce ROS, en los espermatozoides cuando son manipulados en condiciones in vitro durante las técnicas de reproducción asistida, estas células corren el riesgo de generar y ser expuestas a altos niveles fisiológicos de ROS (Du Plessis et al., 2008).

En investigaciones anteriores, no había pruebas de que el sexado de espermatozoides tenía cualidades de hiper activación, una característica de la capacitación que podría promover la fertilización del ovocito. Además en ese mismo estudio, se informó de que la motilidad espermática del semen de la raza cebú (Bos indicus) tuvo un efecto negativo menor por el proceso de sexado en comparación con el semen sexado de toros Bos taurus (López et al., 2015).

Durante el proceso de sexado de espermatozoides con citometría de flujo se provoca estrés en los espermatozoides y causa un aumento en la peroxidación de lípidos de la membrana. La defensa natural contra la oxidación proporcionada por plasma seminal se pierde por la alta dilución durante la clasificación. Esto puede ser más evidente cuando los espermatozoides son procesados para su almacenamiento en nitrógeno líquido que aumenta la peroxidación de lípidos de la membrana.

Una de las principales razones en la reducción de la sobrevivencia de los espermatozoides es la presencia de ROS. Las ROS son conocidas por causar una disminución de la motilidad e inducir pre- capacitación, así como dañar al sistema de membrana por oxidación de los lípidos, especialmente cuando el contenido de plasma seminal se reduce después de extensa dilución y lavado de los espermatozoides. Varios pasos en el proceso de clasificación de los espermatozoides llevan a la producción de las ROS, pero su efecto negativo sobre la peroxidación de lípidos se puede minimizar por la suplementación de medio con sustancias antioxidantes (Espinosa y Córdova, 2013).

La espermatogénesis es un proceso sumamente activo, capaz de generar aproximadamente 1.000 espermatozoides por segundo. Las altas tasas de división celular inherente a este proceso implican correspondientemente altas tasas de consumo de oxígeno mitocondrial por el epitelio germinal. Sin embargo, la pobre vascularización de los testículos provoca que la concentración de oxígeno en este tejido sea baja y que la competencia para este elemento vital dentro de los testículos se intensifique. Además, durante la espermatogénesis y la esteroidogénesis, las células de Leydig son vulnerables al estrés oxidativo, debido a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (Shiraishi and Naito, 2005). Por lo que la baja concentración de oxígeno que caracteriza a este tejido, podría ser un componente importante del mecanismo por el cual el testículo se protege de los daños que causan los radicales libres (Aitken and Roman, 2008).

Estudios previos han demostrado que las células espermáticas tienen menor frecuencia de mutaciones en comparación con las células somáticas. Sin embargo, las células germinales son continuamente afectadas de forma negativa por factores endógenos y exógenos como los ROS afectando el ADN (Celino et al., 2011). También se menciona que los espermatozoides son altamente sensibles a daños inducidos por las ROS, mientras que las espermatogonias son consideradas como tolerantes a las ROS. Se ha reportado que cuando se exponen ratones a estrés calórico leve puede provocar estrés oxidativo, con un gran número de células germinales apoptóticas, mientras que en las espermatogonias la apoptosis es poco frecuente (Paul et al., 2009).

EFECTO DE LAS ROS SOBRE LA MOTILIDAD ESPERMÁTICA

La patología que subyace detrás de la capacidad de los radicales libre para reducir la motilidad del esperma fue informada por Jones et al., (1979), él menciona que las ROS inducen peroxidación de la membrana de esperma, disminuyendo la flexibilidad y por lo tanto el movimiento de la cola. La membrana del esperma es vulnerable a este tipo de daño, ya que contienen grandes cantidades de ácidos grasos insaturados. Las ROS dañan directamente a las mitocondrias, disminuyendo la energía disponible e impedir la movilidad del espermatozoide. Por cualquier mecanismo, el estrés oxidativo afecta la motilidad del esperma y como resultado una menor cantidad de esperma alcanzarán el ovocito para la fertilización (Kao et al., 2008; Tremellen, 2008).

El vínculo entre las ROS y su efecto sobre la motilidad espermática es debido a una cascada de eventos que resultan en una disminución en la fosforilación de las proteínas del axonema y por consecuencia la inmovilización de esperma, ambos procesos están asociados con la reducción en la fluidez de membrana (El-Tohamy, 2012). Otra hipótesis es que el H2O2 puede difundirse a través de las membranas en las células e inhibir la actividad de algunas enzimas tales como la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD). Esta enzima controla la velocidad de flujo de la glucosa a través de la vía hexosa monofosfato, que a su vez, controla la disponibilidad intracelular de fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH). Esto a su vez es utilizado como una fuente de electrones por los espermatozoides para la generación de la ERO por un sistema de enzima conocida como la NADPH oxidasa (Aitken et al., 1998). La inhibición de la G6PD conduce a una disminución en la disponibilidad de NADPH y una acumulación concomitante de glutatión oxidado y glutatión reducido. Esto puede reducir las defensas antioxidantes de los espermatozoides y aumentar la peroxidación de los fosfolípidos de la membrana (El-Tohamy, 2012).

En algunos estudios se ha propuesto que las ROS afectan negativamente la función espermática, tanto in vivo como in vitro. Como es el caso de las técnicas de preparación de espermas para las tecnologías de reproducción asistida (TRA), son causas potenciales para la producción de ROS. Algunos reportes han relacionado la concentración de H2O2 exógeno con los parámetros de motilidad espermática de los niveles de las ROS y de óxido nítrico (NO) para reiterar la importancia de reducir al mínimo los niveles de ROS en TRA. Los resultados mostraron que el H2O2 afectó los parámetros del esperma. El H2O2 fue perjudicial para la motilidad y resultó en un aumento significativo en la generación de ROS y los niveles de ON. Además, se observó un aumento significativo en células estáticas. Aunque este experimento demostró la necesidad de reducir los niveles de ROS exógeno durante TRA, no ilustran la relación causa-efecto de las ROS intracelular y los niveles de ON con la motilidad de los espermatozoides. Por lo que es de vital importancia realizar investigaciones adicionales para definir un nivel patológico de las ROS (Du Plessis et al., 2010).

Para confirmar los efectos negativos de las ROS en la motilidad espermática en Brasil, se llevó a cabo un estudio bajo condiciones tropicales con toros Bradford (5/8 Hereford x 3/8 Nelore), en donde se evaluó el efecto estacional del medio ambiente en la calidad espermática de los sementales. En este estudio se reportó que el gradiente de temperatura (0.9°C), tuvo una correlación positiva entre motilidad y vigor (espermático), con valores 0.36 y 0.35 respectivamente (P<0.05). Mientras que el promedio de motilidad masal fue de (2.58) y una motilidad de (52.64%) y un vigor de (2.7) del semen disminuyó en el verano cuando fue comparado con otras estaciones (P<0.01) (Oliveira et al., 2014). En otro estudio Coulther (1988), reportóo una motilidad espermática de 42% y a un gradiente de temperatura de 2 a 4°C. Fuerst-Waltl et al., (2006), también reporta en toros Simmental australianos un promedio de motilidad espermática de 66.6% y un vigor de 2.93 después de tres colecciones de semen, las cuales corresponden al periodo de maduración espermática en el epidídimo. En las regiones con valores altos de índice de temperatura y humedad, los testículos tienden a ser más afectados, debido a los largos periodos de tiempo que pasan los animales durante el día. Las altas temperaturas provocan dificultad para disipar el calor corporal durante la noche.

El uso de modelos experimentales que ajustan la radiación y la velocidad del viento es fundamental para gestionar la mitigación ambiental y proteger a los animales, garantizando el confort térmico (Mader et al., 2010).

EFECTO DE LAS ROS SOBRE EL ADN

Los radicales libres tienen la capacidad de dañar directamente el ADN del esperma al atacar las bases púricas y pirimídicas y el esqueleto de la desoxirribosa. Normalmente, el ADN del esperma está estrechamente empaquetado por protaminas que lo protegen del ataque de los radicales libres. Sin embargo, los machos infértiles a menudo exhiben deficiencia de protaminación, dejando el ADN del esperma particularmente vulnerables al ataque de las ROS (Oliva, 2006). Alternativamente, los radicales libres pueden iniciar la apoptosis dentro del esperma, que conduce a la degradación enzimática del ADN mediado por las caspasas (Cuadro 1) (Kao et al., 2008).

Existen dos factores por los cuales el material genético es protegido del daño oxidativo: empaquetamiento muy característico del ADN, y los antioxidantes presentes en el plasma seminal. Los antioxidantes se clasifican en enzimáticos y no enzimáticos. Su mecanismo de acción es mediante la dependencia de iones y metales (Cu, Mn, Se y Zn) como la su peróxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa (GR), mientras que el control no enzimático incluye a los antioxidantes como glutatión, ácido ascórbico y ácido úrico como compuestos hidrosolubles, y la vitamina E y los carotenos como liposolubles. El mecanismo de los antioxidantes es clasificado en tres; defensas primarias (previenen la formación de radicales libres), defensas secundarias (inactivan o barren los radicales libres) y defensas terciarias (reparan el daño oxidativo en el ADN) (Perumal, 2014).

Estudios en los que los espermatozoides fueron expuestos a ROS artificialmente, resultó en un aumento significativo de daño al ADN, causando modificaciones a las bases, produciendo daño, cambios en el marco de lectura y reordenamientos cromosómicos. El estrés oxidativo también se ha correlacionado con alta frecuencia de rompimientos de las cadenas dobles y sencillas del ADN (El-Tohamy, 2012).

La confirmación de la relación entre el estrés oxidativo y el daño al ADN de los espermatozoides se ha realizado mediante diversas técnicas como: marcaje de los cortes finales con dUTP mediado por la deoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL), ensayo de la estructura de la cromatina espermática (SCSA) y determinación de subproductos de la oxidación del ADN, 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), (Tremellen, 2008).

En un trabajo reciente se ha observado que la fragmentación del ADN del esperma de carnero aumenta a una temperatura de 30°C y a un índice de temperatura-humedad > 22, en algunas etapas de la espermatogénesis en los animales que llevan el genotipo GG-660 de la -660G/C SNP (Rs397514116). Como el genotipo GG-660 ha sido asociado con niveles bajos de expresión HSP90AA1 en condiciones de estrés calórico se ha sugerido que cantidades subóptimas de ARNm de HSP90AA1 provocan en el ADN de estos animales mayor susceptibilidad a ser fragmentado (Salce-Ortiz et al., 2015).

El estrés oxidativo está relacionado con la fragmentación del ADN espermático y altas concentraciones en células redondas. La evaluación anticipada del estrés oxidativo y el daño del ADN espermático haría una contribución sólida al perfil de análisis seminal estándar y se convertiría en herramientas diagnósticas para la evaluación de la infertilidad del macho, especialmente de origen idiopático, que deben tenerse en cuenta durante el estudio andrológico.

TÉCNICAS PARA DIAGNOSTICAR LA PRESENCIA DE ROS EN LOS ESPERMATOZOIDES

La determinación de ROS en espermatozoides en animales, puede ser usada como una herramienta diagnóstica en la identificación de la etiología de la infertilidad de los animales. La quimioluminiscencia es una de las técnicas más utilizadas para este propósito. Sin embargo, no diferencia entre las ROS producidas por el esperma y las producidas por los leucocitos. Además, los resultados con quimioluminiscencia han sido inconsistentes. Tanto el luminol y las sondas de lucigenin tienen gran sensibilidad, aunque la especificidad está limitada a causa de la interferencia con otros componentes tales como los leucocitos y algunos otros factores de confusión como la edad del semen, el tiempo de análisis posterior a la toma de muestra y la centrifugación aumenta artificialmente la quimioluminiscencia (Alves et al., 2015).

También se puede medir el estrés oxidativo en los espermatozoides, midiendo la presencia de malondialdehído por reacción de ácido tiobarbitúrico (TBA) y los datos se expresan como nanomolar de malondialdehído por miligramo de proteína (nm MDA/mg de proteína) (Upreti et al., 1997).

En el Departamento de Producción Agrícola y Animal de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, estamos trabajando en un proyecto sobre el uso de antioxidantes en la conservación del semen de cerdo, en la actualidad hemos tenidos resultados preliminares alentadores.

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Artículo publicado en Entorno Ganadero